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15.2: Purificación de proteínas (actividad) - Biología


Exclusión de tamaño de moléculas de colorante

Como demostración, el instructor puede ilustrar el concepto de exclusión por tamaño en un juego de colorantes alimentarios mixtos.

Cromatografía de exclusión por tamaño de colorantes alimentarios.

  1. Deje que la columna se vacíe sobre un vaso de precipitados.
  2. Cargue con cuidado 0,2 ml de mezcla de colorante alimentario en la columna.
  3. Coloque 10 tubos en una rejilla debajo de la columna.
  4. Coloque un tampón de 1 ml en la columna y recoja fracciones de 0,5 ml.
  5. Continúe agregando tampón 1 ml a la vez hasta que se hayan recolectado todas las fracciones.

Exclusión de proteínas por tamaño

Este ejercicio busca purificar la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína azul fluorescente (BFP) del lisado bacteriano. Estas proteínas tienen un tamaño específico de 238 aminoácidos y son 40.000 daltons (40kD). Según su tamaño específico, tendrán una tasa de migración específica a través de la resina de exclusión por tamaño. Recuerde que el lisado bacteriano está lleno de proteínas adicionales que no son su proteína de interés que estamos intentando aislar.

Modelo 3D de GFP (Arriba a la izquierda), BFP (Arriba a la derecha), alineación estructural de GFP y BFP (Centro) y la alineación de secuencia (Abajo) que ilustra los 3 cambios de aminoácidos para producir la proteína alternativa. Los asteriscos rojos indican la ubicación de las mutaciones.

Las gotas de líquido se recogerán en fracciones. Las fracciones que contienen las proteínas fluorescentes se encontrarán solo en fracciones específicas que serán visibles bajo iluminación UV.

  1. Monte verticalmente la columna en un soporte de anillo. Asegúrate de que esté recto.
  2. Deslice la tapa sobre el pico en la parte inferior de la columna.
  3. Mezcle bien la lechada (tamiz molecular) agitando o revolviendo suavemente.
  4. Pipetee con cuidado 2 ml de la suspensión mezclada en la columna dejándola fluir por las paredes internas de la columna.
  5. Coloque un vaso de precipitados vacío debajo de la columna para recoger el tampón de lavado.
  6. Retire la tapa de la parte inferior de la columna y deje que la matriz se empaquete en la columna.
  7. Etiquete ocho tubos de microcentrífuga n. ° 1-8.
  8. Cargue lentamente la columna con 0,2 ml del extracto de GFP. Deje que el extracto entre completamente en la columna.
  9. Agregue 1 ml del tampón de elución sobre la resina sin alterar la resina.
  • Agregue el tampón lentamente (varias gotas a la vez) para evitar diluir la muestra de proteína.
  • Usando las marcas graduadas en los lados de los tubos, recolecte fracciones de 0.5ml en los tubos de microcentrífuga etiquetados.
  • Continúe agregando 1 ml de tampón y recoja las fracciones hasta que todos los tubos estén llenos.
  1. Verifique todas las fracciones usando U.V. de onda larga. luz para identificar los tubos que contienen las proteínas fluorescentes GFP o BFP.
  2. Se puede realizar una purificación adicional con una resina diferente con las pocas fracciones que contienen la proteína de interés.
  3. Las muestras de proteínas deben procesarse en un gel de acrilamida y teñirse contra todas las proteínas para verificar la pureza de la muestra o las mediciones de fluorescencia tomadas.

Aislamiento, purificación, clonación de genes y expresión de proteína antifúngica de Bacillus amyloliquefaciens MG-3

La proteína antifúngica se aisló y purificó a partir de B. amyloliquefaciens MG-3.

La proteína antifúngica es una serina proteasa con un peso molecular de

La proteína antifúngica mostró buenas estabilidades a la temperatura, el pH y la proteasa K.

La proteína antifúngica inhibió el crecimiento de hongos patógenos y la descomposición de la fruta en los nísperos.

La proteína antifúngica recombinante suprimió eficazmente el crecimiento de C. acutatum.


Sistema CP5, para una purificación de proteínas simple y altamente eficiente con una mini etiqueta diseñada en C-terminal

Existen muchas estrategias para purificar proteínas recombinantes de interés, y la purificación por afinidad utilizando un anticuerpo monoclonal que se dirige a una secuencia de epítopo lineal es una de las técnicas esenciales utilizadas en la bioquímica y la biología estructural actuales. Aquí presentamos un nuevo sistema de purificación de proteínas utilizando una etiqueta CP5 muy corta. Primero, seleccionamos el clon de anticuerpo monoclonal de conejo anti-receptor de dopamina D1 (DRD1) Ra62 (anticuerpo Ra62) como anticuerpo de captura, e identificamos su secuencia de epítopo mínima como una secuencia de 5 aminoácidos en C-terminal de DRD1 (GQHPT-COOH, Secuencia D1CE). Encontramos que la sustitución de un solo aminoácido en la secuencia D1CE (GQHVT-COOH) aumentó la tasa de disociación hasta 10 veces, y denominó la secuencia de epítopo diseñada etiqueta CP5. Usando el anticuerpo Ra62 y 2 péptidos con diferente afinidad, desarrollamos un nuevo método de purificación de proteínas de afinidad, el sistema CP5. El anticuerpo Ra62 captura rápidamente la proteína diana etiquetada con CP5, y la proteína etiquetada con CP5 capturada se eluyó compitiendo con el péptido D1CE de mayor afinidad. Tomando la diferencia de afinidad entre D1CE y CP5, se logró una elución nítida en condiciones suaves. Utilizando el sistema CP5, purificamos con éxito la deubiquitinasa CYLD y la ubiquitina ligasa E3 MARCH3, y detectamos su actividad catalítica. En cuanto a los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), 9 de los 12 sintetizados libres de células fueron purificados, demostrando su capacidad de purificación de proteínas integrales de membrana. El CHRM2 marcado con CP5 expresado por baculovirus-célula de insecto también se purificó con éxito mediante el sistema CP5. El sistema CP5 ofrece varias ventajas distintas además de su especificidad y rendimiento de elución. La etiqueta CP5 es fácil de construir y manipular debido a su corta longitud, que tiene menos efecto sobre los caracteres de las proteínas. La elución suave del sistema CP5 es particularmente adecuada para preparar proteínas delicadas como enzimas y proteínas de membrana. Nuestros datos demuestran que el sistema CP5 proporciona una nueva opción prometedora en la preparación de muestras de proteínas con alto rendimiento, pureza y actividad para aplicaciones posteriores en análisis funcional y estructural.

Declaracion de conflicto de interes

Intereses en competencia: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.


2. Materiales y métodos

2.1. Intestino delgado de camello

El intestino delgado de camello se obtuvo del matadero de El Cairo. El intestino delgado se guardó directamente en una caja de hielo para su transporte al laboratorio y se transfirió a un almacenamiento congelado a & # x0221280 & # x000a0 & # x000b0C.

2.2. Ensayo de desoxirribonucleasa

Las mediciones de la actividad desoxirribonucleasa (DNasa) se llevaron a cabo de acuerdo con Yasuda et al. [29]. La mezcla de reacción de un ml consistía en 20 & # x000a0 & # x000b5g de ADN de timo de ternera, 10 & # x000a0mM MgCl2, 10 CaCl2, Tampón Tris-HCl 50 & # x000a0mM, pH 7,0 y proteína 2 & # x0201310 & # x000a0 & # x000b5g. Se siguió el cambio de absorbancia a 260 & # x000a0nm a intervalos de 30 & # x000a0s. Una unidad de actividad DNasa se definió como la cantidad de enzima que aumenta la O.D. 1,0 por minuto en condiciones de ensayo estándar.

2.3. Purificación de DNasa de intestino delgado de camello

2.3.1. Preparación de extracto crudo

El extracto crudo de DNasa se preparó por homogeneización de 5 & # x000a0g de intestino delgado de camello en 15 & # x000a0ml de tampón Tris & # x02013HCl 20 & # x000a0mM, pH 7,0 usando un homogeneizador. El homogeneizado se centrifugó a 10.000 & # x000a0gy el sobrenadante se denominó extracto crudo. El extracto crudo se sometió a diálisis contra el mismo tampón.

2.3.2. Cromatografía de columna

El dializado se aplicó directamente a una columna de dietilaminoetanol (DEAE) -Sepharose (10 & # x000a0 & # x000d7 & # x000a01.6 & # x000a0cm i.d.) preequilibrada con el mismo tampón. El material adsorbido se eluyó con un gradiente escalonado de NaCl que variaba de 0,0 a 0,2 & # x000a0M preparado en el mismo tampón a un caudal de 30 & # x000a0ml / hy se recogieron fracciones de 3 ml. Las fracciones agrupadas (NaCl 0,2 & # x000a0M) con la actividad específica más alta de DNasa se concentraron mediante diálisis contra sacarosa sólida y se aplicaron en una columna Sephacryl S-200 (90 & # x000a0 & # x000d7 & # x000a01.6 & # x000a0cm id) previamente equilibrada con el mismo tampón y se desarrolló a un caudal de 20 & # x000a0ml / h, y se recogieron fracciones de 3,0 & # x000a0ml.

2.4. Determinación de proteínas

La proteína se cuantificó mediante el método de Bradford [4]. Se utilizó albúmina de suero bovino como patrón proteico.

2.5. Determinación del peso molecular

El peso molecular se determinó mediante la técnica de filtración en gel utilizando Sephacryl S-200. La columna (90 & # x000a0 & # x000d7 & # x000a01.6 & # x000a0cm d.i.) se calibró con citocromo C (12.400), anhidrasa carbónica (29.000), albúmina de suero bovino (67.000), alcohol deshidrogenasa (150.000) y & # x003b2-amilasa (200.000). Se utilizó azul de dextrano (2.000.000) para determinar el volumen vacío (Vo). El peso molecular de la subunidad se estimó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS [10]. Fosforilasa b desnaturalizada con SDS (94.000), albúmina de suero bovino (67.000), ovoalbúmina (43.000), anhidrasa carbónica (30.000), inhibidor de tripsina de soja (20.000) y & # x003b1-lactoalbúmina (14.200) se utilizaron para la curva de calibración.

2.6. Caracterización de DNasa 3

El efecto del pH sobre la actividad de la DNasa 3 se determinó en el rango de pH de 4.5 a 9.0 usando tampón de acetato de sodio 50 & # x000a0mM (pH 4.5 & # x020136.0), tampón de fosfato de sodio (pH 6.5 & # x020137.5) y Tris- Tampón HCl (pH 7,0 & # x020139,0). La temperatura óptima para la actividad DNasa se determinó incubando las mezclas de enzima-sustrato a diversas temperaturas (10 ° C) en tampón Tris-HCl 50 ° mM, pH 7,0. La estabilidad térmica de la ADNasa se midió en términos de actividad residual después de la incubación de la ADNasa a diferentes temperaturas (10 & # x0201380 & # x000a0 & # x000b0C) durante 1 & # x000a0 h antes de la adición del sustrato. El valor de Km se determinó a partir del gráfico de Lineweaver-Burk usando concentraciones de ADN de 20 a 100 & # x000a0 & # x000b5g. El efecto de los cationes metálicos sobre la actividad DNasa se investigó preincubando la enzima con 10 & # x000a0mM & # x000a0Mg 2+, Ca 2+, Zn 2+, Co 2+, Hg 2+, Ba +, Cd 2+ y Ni 2+ para una hora antes de la adición del sustrato.


Purificación de anticuerpos usando proteína A, proteína G o proteína L agarosa

Este protocolo está diseñado como un método de purificación rápida de anticuerpos de sueros de mamíferos, ascitis y sobrenadantes de cultivos celulares. Cabe señalar que si el material de partida es suero o ascitis, la preparación final contendrá IgG endógena del huésped así como anticuerpos específicos. En general, la presencia de esta IgG endógena no debería interferir con los ensayos que utilizan los anticuerpos. El contenido de inmunoglobulina de sueros normales de varias especies y de fuentes de anticuerpos monoclonales se muestra en la Tabla (PDF).

Nota: Ofrecemos el kit PURE1A para la purificación de anticuerpos utilizando proteína A.

Protocolo de purificación (para una columna de 1 ml)

Notas: Este protocolo utiliza un tampón de carga de alta molaridad y pH alto para la proteína A para mejorar la unión de subclases con una afinidad débil por la proteína A (como la IgG1 de ratón). La unión a la proteína G y L tiene lugar a pH neutro, por lo que se usa solución salina tamponada con fosfato como tampón de carga. La elución de la Ig unida se logra en un solo paso con un tampón de citrato, pH 3, que elimina todas las subclases que se han unido a la resina. La capacidad de la Proteína A y la Proteína G para IgG de varias especies puede estimarse a partir de las afinidades relativas que se dan en la Tabla (PDF). Una subclase de IgG con 1-2 plus se unirá a 1-5 mg de IgG por ml de resina. Una subclase con 3-4 ventajas se unirá a 10-25 mg por ml de resina. La proteína L puede unirse a todas las clases de Ig y puede unir de 3 a 10 mg de Ig por ml de resina para especies con 4 ventajas. Se recomienda que la resina a utilizar tenga al menos 2 ventajas para la especie y la clase de Ig del material a purificar.

Reactivos y equipo

  1. Suero, ascitis o sobrenadante de cultivo celular
  2. Tampón de carga de proteína A: fosfato de potasio 1 M, pH 9,0
  3. Tampón de carga de proteína G o L: solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M, pH 7,4 (número de producto P4417)
  4. Tampón de elución: ácido cítrico 0,1 M, pH 3,0
  5. Base Tris 1,5 M, para neutralización del eluido
  6. 3 - jeringa de 5 ml (manga de columna), lana de vidrio
  7. Llave de paso, Luer-Lock (No de producto S7396)
  8. Soporte de anillo, abrazadera
  9. Tubos de ensayo, gradilla
  10. Espectrofotómetro, cubetas
  11. medidor de pH
  12. Transferir pipetas, bulbos
  13. Vasos, barras de agitación y placa de agitación (para la preparación del tampón)
  14. Unidades de filtrado estériles (opcional)
  15. Azida sódica (conservante) (No de producto S2002)

Procedimiento

  1. Prepare tampones. Los tampones se pueden almacenar a 4 ° C durante 1-2 semanas. La filtración a través de unidades de filtro estériles prolongará la vida útil de los tampones, pero no es necesario.
  2. Prepare la manga de la columna. Retire el émbolo de la jeringa y deséchelo. Presione una pequeña cantidad de lana de vidrio en el fondo de la jeringa, suficiente para formar un cojín de aproximadamente 1/2 - 1 cm de grosor. Coloque la llave de paso. Enjuague con 1-2 ml de tampón de carga. Asegúrese de que el cojín de lana de vidrio permanezca firmemente en el fondo de la jeringa.
  3. Suspenda la resina en 2 ml de tampón de carga invirtiendo y girando la botella. Evite la agitación excesiva. No agite la lechada con vórtex.
  4. Vierta la lechada en la jeringa. Deje que el exceso de tampón se escurra y luego lave la columna con 5 ml de tampón de carga. No permita que la resina se seque por completo.
  5. Si es posible, estime la cantidad de Ig en el suero, ascitis o sobrenadante que se cargará. Si no se conoce la cantidad de Ig, la Tabla (PDF) contiene niveles aproximados de Igs en suero de diferentes especies, en ascitis de ratón y en el sobrenadante de cultivo celular que pueden usarse para estimar la cantidad de Ig en el material de partida. Basado en la capacidad de la resina para Ig de la especie del material de partida (ver Notas arriba) y la cantidad de Ig en el material de partida, calcule el volumen a cargar.

Nota: Estos son valores aproximados, que deben usarse solo como una guía inicial. Las concentraciones reales de Ig en los fluidos y la unión a las resinas variarán y las proporciones óptimas de material de partida a resina deben determinarse experimentalmente.


Descripción del programa

Protein Purification es un programa gratuito en línea desarrollado por el fallecido (junio de 2016) Dr. Andrew G. Booth en la Universidad de Leeds (http://www.agbooth.com/pp_ajax/) 1. El programa ofrece cuatro mezclas de proteínas de variada complejidad para explorar: Easy3 (tres proteínas), Example (seis proteínas), Default (20 proteínas) y Complex (60 proteínas). Los usuarios pueden seleccionar cualquiera de las proteínas dentro de una mezcla para purificar. Las técnicas de separación disponibles son el fraccionamiento con sulfato de amonio, el tratamiento térmico, la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba y la cromatografía de afinidad. Dentro de cada una de estas técnicas, los usuarios pueden modificar varios parámetros. En el caso de la cromatografía de intercambio iónico, se encuentran disponibles medios de intercambio aniónico (Q-Sepharose y DEAE-celulosa) o medios de intercambio catiónico (S-Sepharose y CM-celulosa). Con cualquiera de los dos, los usuarios definen el método de elución como un "gradiente de sal" o un "gradiente de pH". Con el gradiente de sal seleccionado, los usuarios pueden definir el pH del tampón de equilibrio (2.0-11.0) y las concentraciones de sal inicial y final dentro de un rango de 0 a 3.0 m. Cuando se elige una técnica de purificación basada en columna, aparece un cromatograma FPLC que muestra la absorbancia a 280 nm (A280) en la primaria y-eje, número de fracción en el X-eje y [sal] en el secundario y-eje (ver Fig. 1). Aunque no se empleó en nuestro ejercicio, el programa también presenta geles virtuales 1D y 2D (con azul de Coomassie y tinción de inmunotransferencia disponibles) que permiten a los usuarios analizar fracciones de una columna. El programa también contiene una función de ayuda que incluye seis ejercicios tutoriales, pero no es necesario practicar con ellos para el ejercicio descrito en este trabajo. Una búsqueda bibliográfica indica que hay dos publicaciones que utilizan el programa y ambas son del autor del programa 1, 4. Más recientemente, un applet basado en la web que simula una purificación por intercambio iónico de proteínas sobreproducidas a partir de E. coli fue descrito 5. Sin embargo, decidimos utilizar el programa ideado por el Dr. Andrew Booth por su facilidad de uso y versatilidad que se extiende a técnicas más allá de la cromatografía de intercambio iónico 1, 4.

Capturas de pantalla de cromatogramas FPLC utilizando el programa. Cada simulación utilizó la mezcla “Easy3”. Los asteriscos indican la ubicación de la Proteína 1 con la [sal] estimada requerida para la elución dada. Los medios de intercambio iónico, el pH de equilibrio y el gradiente de sal variaron de la siguiente manera:

(A) Q-Sepharose, pH 6,0, sal 0–0,5 m, (B) Q-Sepharose, pH 7,0, sal 0–0,5 m, (C) Q-Sepharose, pH 8,0, sal 0–0,5 m, (D ) Q-Sepharose, pH 10.0, sal 0–0.5 m, (E) Q-Sepharose, pH 10.0, sal 0–1.0 m, (F) DEAE-Celulosa, pH 10.0, sal 0–0.5 m. Paneles con letras según el ejercicio (consulte Información complementaria, página 3). [La figura de color se puede ver en wileyonlinelibrary.com]


Abstracto

La purificación de una proteína es el paso inicial fundamental en el estudio de sus propiedades físicas y biológicas y es uno de los procedimientos más habituales en bioquímica. Este artículo describe un método para enseñar habilidades de purificación a través del aislamiento parcial de ferredoxina-NADP + reductasa y ferredoxina de un solo lote de células. El método se ha utilizado durante varios años en un curso de introducción a la bioquímica utilizando hojas de espinaca como fuente celular. El protocolo da una imagen completa de la preparación de un extracto crudo y el posterior aislamiento de ambas proteínas transportadoras de electrones a escala de laboratorio. Introduce a los estudiantes en el uso de diferentes técnicas para la purificación y detección de proteínas y les permite desarrollar una serie de valiosas habilidades experimentales y analíticas sin tener que recurrir necesariamente a equipos complicados o costosos.

La experiencia de laboratorio ayuda a los estudiantes a desarrollar su pensamiento crítico y creatividad. Además, al realizar trabajos prácticos, aumentan su apreciación de los mecanismos mediante los cuales los científicos obtienen y analizan la información. En realidad, es a través de la formación en el laboratorio que los estudiantes se involucran intensa y personalmente en la adquisición de conocimientos. Partiendo de esta idea, hemos desarrollado en los últimos años una breve formación práctica sobre purificación de proteínas como parte de un curso de bioquímica general.

El trabajo bioquímico requiere con frecuencia la purificación de un compuesto particular a partir de una mezcla compleja. De hecho, las proteínas constituyen uno de los probables candidatos a ser manipulados o aislados por el estudiante de bioquímica a lo largo de su carrera profesional. Como modelo para desarrollar esta habilidad hemos centrado nuestro interés en la purificación de ferredoxina-NADP + reductasa (FNR) 1 1 Las abreviaturas utilizadas son: FNR, ferredoxina-NADP + reductasa DCPIP, 2,6-diclorofenolindofenol. de la espinaca, que además permite la obtención de la proteína ferredoxina como subproducto. Ambas proteínas son de color (FNR es amarillo y ferredoxina es marrón), relativamente abundantes en el material de partida, fáciles de manipular y presentan diferencias bioquímicas pronunciadas, lo que permite a los estudiantes realizar comparaciones interesantes.

FNR es la enzima que contiene FAD responsable de la fotorreducción de NADP + en plantas, algas verdes y cianobacterias [1]. Se ha aislado de muchas fuentes y se ha caracterizado ampliamente. La masa molecular de FNR de la espinaca es de 36.000 Da, y su punto isoeléctrico es de alrededor de 5. La capacidad de FNR para reducir sustratos artificiales como 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) o ferricianuro (actividad diaforasa) usando NADH o NADPH como fuente de electrones [2] permite un fácil reconocimiento de esta enzima en cualquier etapa de purificación.

La ferredoxina es una pequeña proteína portadora de electrones de hierro-azufre que realiza la transferencia de electrones del fotosistema I a FNR y está involucrada en muchas otras cadenas biológicas de transporte de electrones en cianobacterias y plantas, y también se distribuye ampliamente en bacterias [3].

Debido a las características especiales de ambas proteínas y su presencia simultánea en las hojas de espinaca, un material de partida barato y fácilmente disponible en todo el mundo, consideramos que este es un excelente sistema para enseñar los principios de la purificación de proteínas. En la práctica, se instruye al alumno en el proceso lógico de purificación, que parte de una materia prima aplicando algunos pasos preparatorios de purificación. Posteriormente se refina la purificación y se evalúa la pureza del producto obtenido. Al mismo tiempo, se capacita a los estudiantes en algunos aspectos bioquímicos importantes como (a) el estudio de las propiedades espectrales de una proteína, (B) la determinación del curso temporal de la formación del producto en un ensayo catalizado por enzimas con cálculo de las unidades de actividad, (C) la medición de la concentración de proteínas basada en valores obtenidos a partir de datos indirectos utilizando diferentes diluciones, (D) la determinación del peso molecular de una proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, o (mi) la elaboración de un informe escrito.

Esta práctica ha sido diseñada para realizarse en poco tiempo, y la preparación proteica obtenida está solo parcialmente purificada. Sin embargo, explicamos que en las separaciones preparativas, el objetivo principal es aislar y recuperar una cantidad lo más grande posible del compuesto en un alto grado de pureza para posteriormente estudiar su química y / o sus propiedades biológicas. Los estudiantes también aprenden que cualquier procedimiento de purificación adoptado inevitablemente implicará alguna pérdida de material y que es fundamental que el número de pasos de purificación se mantenga al mínimo, por lo que las técnicas utilizadas deben ser aquellas que sean capaces de dar el mayor rendimiento de purificación. .

Con el fin de proporcionar a los estudiantes los antecedentes básicos para una mejor comprensión de esta práctica, está precedida de una breve formación teórica sobre los principios de la purificación de proteínas. Además, se anima a los estudiantes a leer y aprender más sobre los métodos y análisis de purificación de proteínas en los libros de laboratorio de bioquímica disponibles en la universidad. Utilizamos principalmente los textos de Wilson y Walker [4] y Boyer [5]. El desarrollo de este trabajo práctico ha demostrado ser de gran utilidad para plantear preguntas cuya finalidad es animar al alumno a pensar en lo observado y estimular la imaginación del alumno. Hemos comprobado que éste constituye un buen método para una enseñanza didáctica de las ciencias.


Instalación básica de expresión y purificación de proteínas

La instalación de producción y purificación de proteínas es un servicio y recurso fundamental para superar el principal cuello de botella en la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Principalmente brindamos asesoramiento y apoyo activo a la comunidad científica de investigadores en el uso del sistema de expresión procariota y eucariota para la producción de proteínas recombinantes.

La instalación ofrece equipos y materiales necesarios para la expresión de proteínas en células bacterianas, de levadura, de insectos (baculovirus) y de mamíferos. Podemos ejecutar el proceso completo de clonación, expresión, escalado y purificación o tareas específicas dentro del proyecto.

Hemos optimizado diferentes vectores de expresión en combinación con varias cepas bacterianas, cepas de levadura, cepas de insectos y células de mamíferos para la expresión específica de diferentes tipos de proteínas.

Misión

Protein Expression Facility es una plataforma de pago dedicada a brindar asistencia técnica en las siguientes áreas:

  • Asesoramiento y formación
  • Ingeniería de ADN recombinante
  • Expresión de proteínas recombinantes en bacterias y levaduras.
  • Expresión de proteínas recombinantes a través de sistemas de expresión de baculovirus (BVES)
  • Expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos
  • Purificación de proteínas
  • Producción de anticuerpos policlonales

Servicios

La plataforma posee experiencia para producir y purificar cualquier tipo de proteína. Para cada proyecto usamos el siguiente diagrama de flujo:

  • Diseño de cebadores y clonación de vectores de expresión
  • Desarrollo de cepas
  • Examen de expresión
  • Producción y depuración

Otros servicios

  • Preparación y distribución del vector de expresión recombinante
  • Desarrollo de nuevos vectores para proporcionar tecnologías de expresión de vanguardia
  • Mantenimiento de reservas congeladas de baculovirus recombinante
  • Desarrollo de tecnología de purificación de proteínas
  • Desarrollo del catálogo de enzimas de biología molecular y proteínas recombinantes

Equipos

Fermentador para cultivo celular y producción de proteínas
Sistema de cromatografía: para purificación de proteínas
Disrupción celular: extracción de proteínas
Cultivo de células de insectos para la producción de proteínas.
Producción del sistema de hibridoma
Flux Akta para la concentración de la muestra

Red y colaboración

P4EU: iniciativa de red (Asociación de producción y purificación de proteínas en Europa)

Colaboración con la instalación de la plataforma recombinante del Institut Pasteur

Capacitación

La instalación funciona como un centro de capacitación para estudiantes y científicos en clonación de genes y producción de proteínas recombinantes.


Estrategias de purificación de proteínas

Las proteínas son macromoléculas biológicas que mantienen la integridad estructural y funcional de la célula, y muchas enfermedades están asociadas con el mal funcionamiento de las proteínas. La purificación de proteínas es un paso fundamental para analizar proteínas individuales y complejos de proteínas e identificar interacciones con otras proteínas, ADN o ARN. Existe una variedad de estrategias de purificación de proteínas para abordar la escala deseada, el rendimiento y las aplicaciones posteriores. El enfoque óptimo a menudo debe determinarse empíricamente.

Purificación de proteínas

El mejor protocolo de purificación de proteínas depende no solo de la proteína que se purifica, sino también de muchos otros factores, como la célula utilizada para expresar la proteína recombinante (por ejemplo, células procariotas frente a eucariotas). Escherichia coli sigue siendo la primera opción de muchos investigadores para producir proteínas recombinantes debido a la facilidad de uso, el rápido crecimiento celular y el bajo costo de cultivo. Proteínas expresadas en E. coli pueden purificarse en cantidades relativamente altas, pero estas proteínas, especialmente las proteínas eucariotas, pueden no exhibir una actividad o plegamiento proteicos adecuados. Las células de mamíferos cultivadas podrían ofrecer una mejor opción para producir proteínas de mamíferos funcionales y plegadas correctamente con las modificaciones postraduccionales apropiadas (Geisse et al. 1996). Sin embargo, los bajos niveles de expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero cultivadas presentan un desafío para su purificación. Como resultado, lograr un rendimiento y una pureza satisfactorios depende de una captura altamente selectiva y eficaz de estas proteínas de los lisados ​​celulares brutos.

Para simplificar la purificación, las etiquetas de purificación por afinidad se pueden fusionar con una proteína recombinante de interés (Nilsson et al. 1997). Las etiquetas de fusión comunes son polipéptidos, proteínas pequeñas o enzimas añadidas al extremo N o C de una proteína recombinante. Las características bioquímicas de diferentes etiquetas influyen en la estabilidad, solubilidad y expresión de las proteínas a las que están unidas (Stevens et al. 2001). El uso de vectores de expresión que incluyen una etiqueta de fusión facilita la purificación de proteínas recombinantes.

Aislamiento de complejos proteicos

Un objetivo principal de la proteómica es elucidar la función de las proteínas y la organización de las redes complejas que son responsables de los procesos celulares clave. El análisis de las interacciones proteína: proteína puede proporcionar información valiosa sobre las cascadas de señalización celular involucradas en estos procesos, y el análisis de las interacciones proteína: ácido nucleico a menudo revela información importante sobre procesos biológicos como la regulación del ARNm, la remodelación cromosómica y la transcripción. Por ejemplo, los factores de transcripción juegan un papel importante en la regulación de la transcripción al unirse a sitios de reconocimiento específicos en el cromosoma, a menudo en el promotor de un gen, e interactuar con otras proteínas en el núcleo. Esta regulación es necesaria para la viabilidad, diferenciación y crecimiento celular (Mankan et al. 2009 Dios et al. 1998).

El análisis de las interacciones proteína: proteína a menudo requiere métodos sencillos para inmovilizar proteínas en superficies sólidas en las orientaciones adecuadas sin alterar la estructura o función de la proteína. Esta inmovilización no debe interferir con la capacidad de unión y se puede lograr mediante el uso de etiquetas de afinidad. La inmovilización de proteínas en chips es un método popular para analizar proteínas: ADN y proteínas: interacciones de proteínas e identificar componentes de complejos de proteínas (Hall et al. Salón 2004 et al. 2007 Hudson y Snyder, 2006). Los microarrays de proteínas funcionales normalmente contienen proteínas funcionales de longitud completa o dominios de proteínas unidos a una superficie sólida. El ADN marcado con fluorescencia se utiliza para sondear la matriz e identificar las proteínas que se unen a la sonda específica. Los microarrays de proteínas proporcionan un método para la identificación de alto rendimiento de interacciones proteína: ADN. Las proteínas inmovilizadas también se pueden usar en ensayos de reducción de proteínas para aislar compañeros de unión a proteínas in vivo (células de mamífero) o in vitro. Otras aplicaciones posteriores, como la espectrometría de masas, no requieren la inmovilización de proteínas para identificar proteínas asociadas y componentes individuales de complejos de proteínas.


Purificación, sensibilidad redox y propiedades de unión al ARN de la proteína 2 de unión a SECIS, una proteína involucrada en la biosíntesis de selenoproteína

En los ARNm de selenoproteína de mamíferos, el 3 'UTR altamente estructurado contiene elementos de la secuencia de inserción de selenocisteína (SECIS) que se requieren para el reconocimiento de UGA como el codón de selenocisteína. Nuestro trabajo anterior demostró una estrecha correlación entre la lectura de traducción específica de codón y la actividad de una proteína de unión de ARN de 120 kDa que interactuó específicamente con el elemento SECIS en el ARNm de hidroperóxido de fosfolípido glutatión peroxidasa. Este estudio informa sobre la unión de ARN y las propiedades bioquímicas de esta proteína, la proteína 2 de unión a SECIS (SBP2). Detectamos actividad de unión a SBP2 en extractos de hígado, células de hepatoma y testículos a partir de los cuales se purificó SBP2 por intercambio aniónico y cromatografía de afinidad de ARN. Este esquema nos ha permitido identificar un polipéptido de 120 kDa que coeluye con la actividad de unión a SBP2 de las columnas de afinidad de ARN de tipo salvaje pero no mutante. Una caracterización de las propiedades bioquímicas de SBP2 revela que la unión de SBP2 es sensible a la oxidación y la presencia de heparina, rRNA y poli (G). La actividad de SBP2 eluye con una masa molecular de aproximadamente 500 kDa durante la cromatografía de filtración en gel, lo que sugiere la existencia de un gran complejo funcional. Los experimentos de reticulación directa y competición demuestran que el sitio de unión 3 'UTR de glutatión peroxidasa de hidroperóxido de fosfolípido mínimo está entre 82 y 102 nucleótidos, lo que se correlaciona con la secuencia mínima necesaria para la lectura completa de la traducción. SBP2 también interactúa específicamente con la UTR 3 'mínimamente funcional de otro ARNm de selenoproteína, la desyodasa 1.


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