Información

¿Existe una noción de RMSD para dos moléculas diferentes?


La (mínima) desviación cuadrática media de la raíz se utiliza para comparar diferentes conformaciones de la misma molécula. Sin embargo, uno puede estar interesado en comparar las conformaciones de dos moléculas diferentes, p. dos proteínas de diferentes longitudes de columna vertebral. Entonces, ¿existe algún método para comparar conformaciones de diferentes moléculas, como un RMDS generalizado?


PyMOL ("alinear molécula1, molécula2" devuelve estructuras alineadas y RMSD). TM-align (devuelve estructuras alineadas y TM-score; tmalign.py es un módulo de Python para ejecutar TM-align usando PyMOL).


Enfoques computacionales para la predicción, el análisis y el diseño de la estructura del ARN

Las moléculas de ARN son componentes celulares importantes involucrados en muchos procesos biológicos fundamentales. Comprender los mecanismos detrás de sus funciones requiere conocimiento de la estructura terciaria del ARN. Aunque los enfoques de modelado para el estudio de las estructuras y la dinámica del ARN van a la zaga de los esfuerzos en el plegamiento de proteínas, se han logrado muchos avances en los últimos dos años. Aquí, revisamos los avances recientes en los algoritmos de plegamiento de ARN, el descubrimiento de motivos terciarios de ARN, las aplicaciones de los enfoques de la teoría de grafos a la estructura y función del ARN, y en silico generación de conjuntos de secuencias de ARN para el diseño de aptámeros. Los avances dentro de cada área se pueden combinar para impactar muchos problemas en la estructura y función del ARN.

Reflejos

► Revisamos los avances recientes en los algoritmos de plegamiento de ARN y el descubrimiento de motivos terciarios de ARN. ► También se incluyen aplicaciones de enfoques de teoría de grafos a la estructura y función del ARN, y en silico generación de conjuntos de secuencias de ARN para el diseño de aptámeros. ► Discutimos cómo los avances dentro de cada área se pueden combinar para impactar muchos problemas en la estructura y función del ARN.


¿Por qué es interesante estudiar Hsp90?

La proteína de choque térmico de 90 kDa (Hsp90) es una proteína acompañante responsable de catalizar la conversión de una amplia variedad de proteínas en una forma funcional.Ejemplos de la clientela Hsp90, que totaliza varios cientos de proteínas, incluyen receptores nucleares de hormonas esteroides y proteína quinasas (Pearl y Prodromou 2006). El mecanismo por el cual actúa Hsp90 varía entre los clientes, al igual que el sitio de unión del cliente, el proceso depende de las modificaciones postraduccionales de Hsp90 y la identidad de las co-chaperonas que se unen y regulan el ciclo conformacional (Schopf et al. 2017).

Debido a su papel bioquímico vital como proteína acompañante involucrada en facilitar el plegamiento de muchas proteínas de los clientes, Hsp90 es un objetivo farmacéutico atractivo. En particular, dado que el plegamiento de proteínas es un cuello de botella potencial para la reproducción y el crecimiento celular, el bloqueo de la función de Hsp90 utilizando inhibidores que se unen estrechamente al sitio de unión de ATP del NTD podría ayudar a tratar el cáncer, por ejemplo, el antibiótico geldanamicina y sus análogos están bajo investigación como posibles agentes antitumorales (Stebbins et al. 1997, Hermane et al. 2019).

En la estructura que se examinará durante este tutorial, el ligando en cuestión es un resorcinol, una clase común de compuestos con afinidad por el dominio N-terminal de Hsp90. Está registrado en la base de datos de PubChem con el número de identificación del compuesto 135508238 (PubChem). Como se puede ver al observar la estructura PDB, la parte de resorcinol de la estructura está incrustada en el sitio de unión, unida por un enlace de hidrógeno al residuo aspartato-93. La estructura del ligando también contiene un triazol y un anillo de fluorofenilo, que se encuentran más cerca de la superficie de la proteína.

Figura 1: Estructura de Hsp90, con un ligando unido. Haga clic para ver en NGL. (Rosa et al. 2018)


Galectinas en biología celular

Descifrar la compleja estructura del patrón dulce elegantemente dispuesto sobre diferentes superficies celulares requiere una amplia variedad de biomoléculas diseñadas específicamente para interactuar con cada resto particular. Comprender la estructura, la dinámica y el mecanismo de reconocimiento de las proteínas responsables de este papel es, por lo tanto, de fundamental relevancia para obtener una comprensión más profunda de los procesos biológicos subyacentes involucrados y desarrollar posibles intervenciones terapéuticas. Las galectinas son uno de los principales grupos de proteínas de reconocimiento de carbohidratos y, en los seres humanos, están involucradas en una variedad de procesos fisiológicos, muchos de los cuales están directamente relacionados con la inmunidad y la enfermedad.

Las galectinas surgieron últimamente como actores novedosos en la modulación de procesos fisiopatológicos. Han estado implicados en muchas actividades biológicas, que van desde procesos funcionales de desarrollo temprano, programas de vascularización, migración celular y regulación de las células del sistema inmunológico hasta resoluciones pro o antiinflamatorias (Liu y Rabinovich, 2010 Di Lella et al., 2011). Thiemann y Baum, 2016). Las galectinas están profundamente involucradas en el reconocimiento y la muerte de patógenos, y en la facilitación de la entrada de patógenos microbianos y parásitos en el hospedador (Vasta, 2009 Yang et al., 2011 Baum et al., 2014 Lujan et al., 2018). Durante la infección, son los intermediarios sutiles que descifran la información que contiene glucanos sobre las células inmunitarias del huésped y las estructuras microbianas y, por lo tanto, modulan una diversidad de eventos de señalización que conducen a la proliferación celular, supervivencia, quimiotaxis, tráfico, secreción de citocinas y célula-célula. comunicación.

Extracelularmente, la mayoría de las galectinas actúan como receptores solubles de reconocimiento de patrones de la superficie celular, regulando así la comunicación célula-célula (Arthur et al., 2015b). Su actividad de lectina, dirigida específicamente hacia restos de galactósido & # x003B2, se acopla con un equilibrio de dimerización, en una estructura de dominio de unión de múltiples carbohidratos en tándem, u otras estrategias de oligomerización, que provocan la formación de estructuras supramoleculares muy complejas, a menudo descritas como retículas ( Sacchettini y col., 2001). En resumen, el mecanismo a través del cual se logran las funciones extracelulares de la galectina se basa tanto en su especificidad de unión a carbohidratos como en sus capacidades de formación de redes, que están estrechamente relacionadas con la estructura de la galectina.


2. METODOLOGÍA

2.1 Recuperación de datos y modelado de variantes

Recientemente, se informaron nuevas cepas de SARS-CoV-2 en Inglaterra, Sudáfrica y Brasil, que tiene una alta velocidad de transmisión y se afirma que es muy contagiosa. Las mutaciones previstas en nuevas cepas se encontraron en la proteína Spike, que desempeña un papel indispensable en la unión del virus a la célula huésped. Manteniendo la importancia de la proteína Spike en la infección viral, recuperamos la última secuencia de aminoácidos enviada de la proteína SARS-CoV-2 Spike de UniProt (Magrane, 2011) disponible con el número de acceso: P0DTC2 para identificar la ubicación exacta de las mutaciones recién surgidas. Finalmente, la estructura de tipo salvaje reportada (6M0J) de SARS-CoV-2 (Lan et al., 2020) Spike protein se obtuvo de un banco de datos de proteínas (Rose et al., 2010) y se usó para el modelado de variantes por el software Chimera. (Goddard et al., 2005).

2.2 Acoplamiento proteína-proteína y determinación de la constante de disociación (KD)

El algoritmo de acoplamiento proteína-proteína impulsado por alta ambigüedad (HADDOCK) que utiliza datos de interacción biofísica y bioquímica como mutagénesis, restricciones de interacción ambigua (AIR) y perturbación del cambio químico de los experimentos de titulación de RMN se utilizó para realizar el proceso de acoplamiento proteína-proteína (Dominguez et al., 2003). Para predecir el acoplamiento, usamos la interfaz Guru, que se sabe que es la interfaz más fuerte entre las cuatro interfaces propiedad del servidor HADDOCK. La interfaz Guru utiliza aproximadamente 500 características para el acoplamiento proteína-proteína / ADN / ARN. Además, para dar una idea convincente de la KD (constante de disociación) se calculó utilizando la predicción PROtein binDIng enerGY (PRODIGY), que es un servidor en línea para calcular la afinidad de unión y KD para diferentes complejos biológicos (Xue et al., 2016).

2.3 Simulación de dinámica molecular de los complejos superiores

El comportamiento dinámico del tipo salvaje complejo, K417N-E484K-N501Y, K417T- E484K-N501Y, E484K, N501Y y E484K-N501Y se comprobó mediante simulación MD realizada en Amber20 (Salomon-Ferrer et al., 2013) utilizando el campo de fuerza FF14SB . La solvatación del sistema se realizó en una caja de agua TIP3P y el sistema se neutralizó mediante la adición de contraiones (Price & Brooks, 2004). Se utilizó el protocolo de minimización de energía para eliminar los malos enfrentamientos en el sistema. El algoritmo de descenso más pronunciado (Meza, 2010) y el algoritmo de gradiente conjugado se utilizaron para 6000 y 3000 ciclos, respectivamente (Watowich et al., 1988). Después de calentar hasta 300 K, el sistema se equilibró a una presión constante de 1 atm con una restricción débil y luego se equilibró sin ninguna restricción. Finalmente, el paso de producción se ejecutó durante 100 ns. La interacción electrostática de largo alcance se trató con el algoritmo de Ewald de malla de partículas (Salomon-Ferrer et al., 2013) con una distancia de corte de 10.0 Å. El algoritmo SHAKE se utilizó para tratar un enlace covalente (Kräutler et al., 2001). El paso de producción de la simulación MD se realizó en PMEMD.CUDA y las trayectorias se procesaron utilizando el paquete Amber20 CPPTRAJ (Roe & Cheatham, 2013).

2.4 Cálculos vinculantes de energía libre

Para estimar los cálculos de energía de enlace real del tipo salvaje, se utilizó el enfoque K417N-E484K-N501Y, K417T-E484K-N501Y, E484K, N501Y y E484K-N501Y, MMGBSA. Este método es el mejor enfoque utilizado por diferentes estudios para estimar la energía de unión real de diferentes complejos biológicos, como Spike proteína-ligando, proteína-proteína y proteína-ADN / ARN (Ali et al., 2019 Khan et al., 2018 Khan et al., 2019 Khan et al., 2020a 2020b 2020c 2020d). Se utilizó el script MMGBSA.py (Hou et al., 2011) para estimar la energía libre de unión total de los complejos de ligandos superiores. Cada término de energía, como vdW, electrostático, GB y SA, se calculó como parte de la energía de enlace total.


métodoalgoritmocampo de fuerzasolvente
DesmondMarylandOPLS 2.1Explícito
MacromodeloMD de modo bajoOPLS05GB / SA
MOEMD de modo bajoAMBER10SRF
principalMuestreo de torsiónOPLS05Vacío
OMEGADGMMFF94Sheffield
RDKit_DGDGMMFF94Vacío

Los métodos utilizados en el estudio Sindhikara están en letra normal, los métodos agregados en este estudio están en cursiva.


Conclusiones

La “vida” es un concepto con dos aspectos completamente distintos: la evolución darwiniana y la autosuficiencia. Un esfuerzo por definir "vida" debería describir los dos aspectos por separado, como alguna expresión como: "Una forma de vida es una forma de materia capaz de sufrir una evolución darwiniana. Evolución darwiniana y podría comprometerse en una evolución darwiniana adicional ”. Alternativamente, debido a que "autosostenible" tiene un sentido borroso y se deriva de la evolución darwiniana en la naturaleza, uno que persigue una definición clara y concisa puede estar más satisfecho con una declaración que solo enfatice la evolución darwiniana, como: "La vida es la forma capaz de sufrir una evolución darwiniana ”.

En cuanto a su implementación en la naturaleza, la vida parece ser un milagro, debido a tres mecanismos químicos mágicos (para darse cuenta de sus dos aspectos): la replicación de polímeros similares a ADN / ARN por emparejamiento de residuos, el plegamiento dependiente de secuencia de ARN / proteína. polímeros similares a los que engendran funciones especiales, y el ensamblaje de anfífilos similares a fosfolípidos que forman vesículas.

La forma de vida de una entidad viviente se puede definir en términos de información, es decir, su información genética, la selección natural es la clave para dar lugar a dicha información, que se ha acumulado durante numerosas generaciones.

La disección sobre la esencia de la vida mejoraría nuestro conocimiento sobre toda la disciplina de la biología, “profundizando” su “éxito” en la actualidad. De manera más general, puede promover aún más nuestra comprensión fundamental de los fenómenos naturales. Más particularmente, puede tener una influencia directa en campos como el origen de la vida, la vida artificial y la astrobiología.


4.1 Energía y metabolismo

Los científicos utilizan el término bioenergética para describir el concepto de flujo de energía (Figura 4.2) a través de sistemas vivos, como las células. Los procesos celulares como la construcción y descomposición de moléculas complejas ocurren a través de reacciones químicas escalonadas. Algunas de estas reacciones químicas son espontáneas y liberan energía, mientras que otras requieren energía para continuar. Así como los seres vivos deben consumir alimentos continuamente para reponer sus suministros de energía, las células deben obtener continuamente más energía para reponer la utilizada por las muchas reacciones químicas que requieren energía y que tienen lugar constantemente. En conjunto, todas las reacciones químicas que tienen lugar dentro de las células, incluidas las que consumen o generan energía, se denominan metabolismo celular.

Vías metabólicas

Considere el metabolismo del azúcar. Este es un ejemplo clásico de uno de los muchos procesos celulares que usan y producen energía. Los seres vivos consumen azúcares como principal fuente de energía, porque las moléculas de azúcar tienen una gran cantidad de energía almacenada dentro de sus enlaces. En su mayor parte, los organismos fotosintetizadores como las plantas producen estos azúcares. Durante la fotosíntesis, las plantas usan energía (originalmente de la luz solar) para convertir gas dióxido de carbono (CO2) en moléculas de azúcar (como glucosa: C6H12O6). Consumen dióxido de carbono y producen oxígeno como producto de desecho. Esta reacción se resume como:

Debido a que este proceso implica sintetizar una molécula de almacenamiento de energía, requiere un aporte de energía para continuar. Durante las reacciones de luz de la fotosíntesis, la energía es proporcionada por una molécula llamada trifosfato de adenosina (ATP), que es la moneda de energía primaria de todas las células. Así como el dólar se usa como moneda para comprar bienes, las células usan moléculas de ATP como moneda de energía para realizar un trabajo inmediato. Por el contrario, las moléculas de almacenamiento de energía, como la glucosa, se consumen solo para descomponerse y utilizar su energía. La reacción que recolecta la energía de una molécula de azúcar en las células que requieren oxígeno para sobrevivir se puede resumir en la reacción inversa a la fotosíntesis. En esta reacción, se consume oxígeno y se libera dióxido de carbono como producto de desecho. La reacción se resume como:

Ambas reacciones implican muchos pasos.

Los procesos de fabricación y descomposición de moléculas de azúcar ilustran dos ejemplos de vías metabólicas. Una vía metabólica es una serie de reacciones químicas que toman una molécula inicial y la modifican, paso a paso, a través de una serie de intermediarios metabólicos, para finalmente producir un producto final. En el ejemplo del metabolismo del azúcar, la primera vía metabólica sintetizaba el azúcar a partir de moléculas más pequeñas y la otra vía descomponía el azúcar en moléculas más pequeñas. Estos dos procesos opuestos, el primero que requiere energía y el segundo que produce energía, se denominan vías anabólicas (construcción de polímeros) y vías catabólicas (descomposición de los polímeros en sus monómeros), respectivamente. En consecuencia, el metabolismo se compone de síntesis (anabolismo) y degradación (catabolismo) (Figura 4.3).

Es importante saber que las reacciones químicas de las vías metabólicas no ocurren por sí solas. Cada paso de la reacción es facilitado o catalizado por una proteína llamada enzima. Las enzimas son importantes para catalizar todo tipo de reacciones biológicas, tanto las que requieren energía como las que la liberan.

Energía

La termodinámica se refiere al estudio de la energía y la transferencia de energía que involucra materia física. La materia relevante para un caso particular de transferencia de energía se llama sistema, y ​​todo lo que está fuera de esa materia se llama entorno. Por ejemplo, al calentar una olla de agua en la estufa, el sistema incluye la estufa, la olla y el agua. La energía se transfiere dentro del sistema (entre la estufa, la olla y el agua). Hay dos tipos de sistemas: abiertos y cerrados. En un sistema abierto, la energía se puede intercambiar con su entorno. El sistema de la estufa está abierto porque se puede perder calor en el aire. Un sistema cerrado no puede intercambiar energía con su entorno.

Los organismos biológicos son sistemas abiertos. La energía se intercambia entre ellos y su entorno a medida que utilizan la energía del sol para realizar la fotosíntesis o consumen moléculas que almacenan energía y liberan energía al medio ambiente haciendo trabajo y liberando calor. Como todas las cosas en el mundo físico, la energía está sujeta a leyes físicas. Las leyes de la termodinámica gobiernan la transferencia de energía en y entre todos los sistemas del universo.

En general, la energía se define como la capacidad de realizar un trabajo o de crear algún tipo de cambio. La energía existe en diferentes formas. Por ejemplo, la energía eléctrica, la energía luminosa y la energía térmica son todos tipos diferentes de energía. Para apreciar la forma en que la energía entra y sale de los sistemas biológicos, es importante comprender dos de las leyes físicas que gobiernan la energía.

Termodinámica

La primera ley de la termodinámica establece que la cantidad total de energía en el universo es constante y se conserva. En otras palabras, siempre ha habido, y siempre habrá, exactamente la misma cantidad de energía en el universo. La energía existe en muchas formas diferentes. Según la primera ley de la termodinámica, la energía puede transferirse de un lugar a otro o transformarse en diferentes formas, pero no puede crearse ni destruirse. Las transferencias y transformaciones de energía ocurren a nuestro alrededor todo el tiempo. Las bombillas transforman la energía eléctrica en luz y energía térmica. Las estufas de gas transforman la energía química del gas natural en energía térmica. Las plantas realizan una de las transformaciones de energía biológicamente más útiles de la tierra: la de convertir la energía de la luz solar en energía química almacenada en moléculas orgánicas (Figura 4.2). En la figura 4.4 se muestran algunos ejemplos de transformaciones de energía.

El desafío para todos los organismos vivos es obtener energía de su entorno en formas que puedan transferir o transformar en energía utilizable para realizar su trabajo. Las células vivas han evolucionado para hacer frente a este desafío. La energía química almacenada dentro de moléculas orgánicas como azúcares y grasas se transfiere y transforma a través de una serie de reacciones químicas celulares en energía dentro de moléculas de ATP. La energía en las moléculas de ATP es fácilmente accesible para realizar el trabajo. Ejemplos de los tipos de trabajo que las células deben realizar incluyen construir moléculas complejas, transportar materiales, impulsar el movimiento de los cilios o flagelos y contraer las fibras musculares para crear movimiento.

Las tareas principales de una célula viva de obtener, transformar y utilizar energía para realizar un trabajo pueden parecer sencillas. Sin embargo, la segunda ley de la termodinámica explica por qué estas tareas son más difíciles de lo que parecen. Todas las transferencias y transformaciones de energía nunca son completamente eficientes. En cada transferencia de energía, se pierde cierta cantidad de energía en una forma inutilizable. En la mayoría de los casos, esta forma es energía térmica. Termodinámicamente, la energía térmica se define como la energía transferida de un sistema a otro que no funciona. Por ejemplo, cuando se enciende una bombilla, parte de la energía que se convierte de energía eléctrica en energía luminosa se pierde en forma de energía térmica. Asimismo, se pierde algo de energía como energía térmica durante las reacciones metabólicas celulares.

Un concepto importante en los sistemas físicos es el de orden y desorden. Cuanta más energía pierde un sistema en su entorno, menos ordenado y más aleatorio es el sistema. Los científicos se refieren a la medida de aleatoriedad o desorden dentro de un sistema como entropía. Alta entropía significa alto desorden y poca energía. Las moléculas y las reacciones químicas también tienen una entropía variable. Por ejemplo, la entropía aumenta a medida que las moléculas en una alta concentración en un lugar se difunden y se esparcen. La segunda ley de la termodinámica dice que la energía siempre se perderá como calor en las transferencias o transformaciones de energía.

Los seres vivos están muy ordenados y requieren un aporte de energía constante para mantenerse en un estado de baja entropía.

Energía potencial y cinética

Cuando un objeto está en movimiento, hay energía asociada con ese objeto. Piense en una bola de demolición. Incluso una bola de demolición de movimiento lento puede causar mucho daño a otros objetos. La energía asociada con los objetos en movimiento se llama energía cinética (Figura 4.5). Una bala acelerada, una persona que camina y el movimiento rápido de moléculas en el aire (que produce calor) tienen energía cinética.

Ahora, ¿qué pasa si esa misma bola de demolición inmóvil se levanta dos pisos por encima del suelo con una grúa? Si la bola de demolición suspendida no se mueve, ¿hay energía asociada con ella? La respuesta es sí. La energía que se requería para levantar la bola de demolición no desapareció, pero ahora se almacena en la bola de demolición en virtud de su posición y la fuerza de gravedad que actúa sobre ella. Este tipo de energía se llama energía potencial (Figura 4.5). Si la pelota cayera, la energía potencial se transformaría en energía cinética hasta que toda la energía potencial se agotara cuando la pelota descansara en el suelo. Las bolas de demolición también se balancean como un péndulo a través del columpio, hay un cambio constante de energía potencial (más alta en la parte superior del columpio) a energía cinética (más alta en la parte inferior del columpio). Otros ejemplos de energía potencial incluyen la energía del agua retenida detrás de una presa o una persona a punto de saltar en paracaídas desde un avión.

La energía potencial no solo está asociada con la ubicación de la materia, sino también con la estructura de la materia. Incluso un resorte en el suelo tiene energía potencial si se comprime, lo mismo ocurre con una banda elástica que se tensa. A nivel molecular, los enlaces que mantienen unidos los átomos de las moléculas existen en una estructura particular que tiene energía potencial. Recuerde que las vías celulares anabólicas requieren energía para sintetizar moléculas complejas a partir de otras más simples y las vías catabólicas liberan energía cuando se descomponen moléculas complejas. El hecho de que la energía pueda ser liberada por la ruptura de ciertos enlaces químicos implica que esos enlaces tienen energía potencial. De hecho, hay energía potencial almacenada dentro de los enlaces de todas las moléculas de alimentos que comemos, que eventualmente se aprovecha para su uso. Esto se debe a que estos enlaces pueden liberar energía cuando se rompen. El tipo de energía potencial que existe dentro de los enlaces químicos y que se libera cuando esos enlaces se rompen se llama energía química. La energía química es responsable de proporcionar a las células vivas la energía de los alimentos. La liberación de energía ocurre cuando se rompen los enlaces moleculares dentro de las moléculas de los alimentos.

Conceptos en acción

Visite el sitio y seleccione "Péndulo" en el menú "Trabajo y energía" para ver el cambio de energía cinética y potencial de un péndulo en movimiento.

Energía libre y de activación

Después de aprender que las reacciones químicas liberan energía cuando se rompen los enlaces que almacenan energía, la siguiente pregunta importante es la siguiente: ¿Cómo se cuantifica y expresa la energía asociada con estas reacciones químicas? ¿Cómo se puede comparar la energía liberada por una reacción con la de otra reacción? Se utiliza una medida de energía libre para cuantificar estas transferencias de energía. Recuerde que de acuerdo con la segunda ley de la termodinámica, todas las transferencias de energía implican la pérdida de cierta cantidad de energía en una forma inutilizable como el calor. La energía libre se refiere específicamente a la energía asociada con una reacción química que está disponible después de contabilizar las pérdidas. En otras palabras, la energía libre es energía utilizable o energía que está disponible para realizar un trabajo.

Si se libera energía durante una reacción química, entonces el cambio en la energía libre, representado como ∆G (delta G) será un número negativo. Un cambio negativo en la energía libre también significa que los productos de la reacción tienen menos energía libre que los reactivos, porque liberan algo de energía libre durante la reacción. Las reacciones que tienen un cambio negativo en la energía libre y, en consecuencia, liberan energía libre se denominan reacciones exergónicas. Pensar: exergonómico significa que la energía es exiting el sistema. Estas reacciones también se denominan reacciones espontáneas y sus productos tienen menos energía almacenada que los reactivos. Debe establecerse una distinción importante entre el término espontáneo y la idea de una reacción química que ocurre inmediatamente. Contrariamente al uso cotidiano del término, una reacción espontánea no es una que ocurre repentina o rápidamente. La oxidación del hierro es un ejemplo de una reacción espontánea que se produce lentamente, poco a poco, con el tiempo.

Si una reacción química absorbe energía en lugar de liberar energía en equilibrio, entonces el ∆G para esa reacción será un valor positivo. En este caso, los productos tienen más energía libre que los reactivos. Por tanto, los productos de estas reacciones pueden considerarse moléculas que almacenan energía. Estas reacciones químicas se denominan reacciones endergónicas y no son espontáneas. Una reacción endergónica no se producirá por sí sola sin la adición de energía libre.

Conexión visual

Observa cada uno de los procesos que se muestran y decide si es endergónico o exergónico.

Hay otro concepto importante que debe considerarse con respecto a las reacciones endergónicas y exergónicas. Las reacciones exergónicas requieren una pequeña cantidad de energía para ponerse en marcha, antes de que puedan continuar con sus pasos de liberación de energía. Estas reacciones tienen una liberación neta de energía, pero aún requieren algo de entrada de energía al principio. Esta pequeña cantidad de entrada de energía necesaria para que ocurran todas las reacciones químicas se llama energía de activación.

Conceptos en acción

Vea una animación del paso de la energía libre al estado de transición de la reacción.

Enzimas

Una sustancia que ayuda a que ocurra una reacción química se llama catalizador y las moléculas que catalizan las reacciones bioquímicas se llaman enzimas. La mayoría de las enzimas son proteínas y realizan la tarea crítica de reducir las energías de activación de las reacciones químicas dentro de la célula. La mayoría de las reacciones críticas para una célula viva ocurren con demasiada lentitud a temperaturas normales como para ser de alguna utilidad para la célula. Sin enzimas para acelerar estas reacciones, la vida no podría persistir. Las enzimas hacen esto uniéndose a las moléculas reactivas y reteniéndolas de tal manera que los procesos químicos de ruptura y formación de enlaces tengan lugar más fácilmente. Es importante recordar que las enzimas no cambian si una reacción es exergónica (espontánea) o endergónica. Esto se debe a que no cambian la energía libre de los reactivos o productos. Solo reducen la energía de activación requerida para que la reacción avance (Figura 4.7). Además, una enzima en sí no se modifica por la reacción que cataliza. Una vez que se ha catalizado una reacción, la enzima puede participar en otras reacciones.

Los reactivos químicos a los que se une una enzima se denominan sustratos de la enzima. Puede haber uno o más sustratos, dependiendo de la reacción química particular. En algunas reacciones, un solo sustrato reactivo se descompone en múltiples productos. En otros, dos sustratos pueden unirse para crear una molécula más grande. Dos reactivos también pueden entrar en una reacción y ambos se modifican, pero dejan la reacción como dos productos. La ubicación dentro de la enzima donde se une el sustrato se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es donde ocurre la "acción". Dado que las enzimas son proteínas, existe una combinación única de cadenas laterales de aminoácidos dentro del sitio activo. Cada cadena lateral se caracteriza por diferentes propiedades. Pueden ser grandes o pequeños, débilmente ácidos o básicos, hidrófilos o hidrófobos, con carga positiva o negativa o neutrales. La combinación única de cadenas laterales crea un entorno químico muy específico dentro del sitio activo. Este entorno específico es adecuado para unirse a un sustrato químico específico (o sustratos).

Los sitios activos están sujetos a las influencias del entorno local. El aumento de la temperatura ambiental generalmente aumenta las velocidades de reacción, catalizadas por enzimas o de otro modo. Sin embargo, las temperaturas fuera de un rango óptimo reducen la velocidad a la que una enzima cataliza una reacción. Las altas temperaturas eventualmente harán que las enzimas se desnaturalicen, un cambio irreversible en la forma tridimensional y, por lo tanto, en la función de la enzima. Las enzimas también son adecuadas para funcionar mejor dentro de un cierto rango de pH y concentración de sal y, al igual que con la temperatura, el pH extremo y las concentraciones de sal pueden hacer que las enzimas se desnaturalicen.

Durante muchos años, los científicos pensaron que la unión enzima-sustrato se realizaba de una manera simple de "cerradura y llave". Este modelo afirmó que la enzima y el sustrato encajan perfectamente en un paso instantáneo. Sin embargo, la investigación actual respalda un modelo llamado ajuste inducido (Figura 4.8). El modelo de ajuste inducido se expande en el modelo de cerradura y llave al describir una unión más dinámica entre la enzima y el sustrato. A medida que la enzima y el sustrato se unen, su interacción provoca un cambio leve en la estructura de la enzima que forma una disposición de unión ideal entre la enzima y el sustrato.

Conceptos en acción

Cuando una enzima se une a su sustrato, se forma un complejo enzima-sustrato. Este complejo reduce la energía de activación de la reacción y promueve su rápida progresión de una de las múltiples formas posibles. En un nivel básico, las enzimas promueven reacciones químicas que involucran a más de un sustrato al juntar los sustratos en una orientación óptima para la reacción. Otra forma en que las enzimas promueven la reacción de sus sustratos es creando un ambiente óptimo dentro del sitio activo para que ocurra la reacción. Las propiedades químicas que surgen de la disposición particular de los grupos R de aminoácidos dentro de un sitio activo crean el ambiente perfecto para que reaccionen los sustratos específicos de una enzima.

El complejo enzima-sustrato también puede reducir la energía de activación al comprometer la estructura de enlace para que sea más fácil de romper. Finalmente, las enzimas también pueden reducir las energías de activación al participar en la reacción química en sí. En estos casos, es importante recordar que la enzima siempre volverá a su estado original cuando se complete la reacción. Una de las propiedades distintivas de las enzimas es que, en última instancia, permanecen inalteradas por las reacciones que catalizan. Después de que una enzima ha catalizado una reacción, libera su (s) producto (s) y puede catalizar una nueva reacción.

Parecería ideal tener un escenario en el que todas las enzimas de un organismo existieran en abundancia y funcionaran de manera óptima en todas las condiciones celulares, en todas las células, en todo momento. Sin embargo, una variedad de mecanismos asegura que esto no suceda. Las necesidades y condiciones celulares varían constantemente de una célula a otra y cambian dentro de las células individuales con el tiempo. Las enzimas necesarias de las células del estómago difieren de las de las células de almacenamiento de grasa, las células de la piel, las células sanguíneas y las células nerviosas. Además, una célula de un órgano digestivo trabaja mucho más para procesar y descomponer los nutrientes durante el tiempo que sigue de cerca a una comida en comparación con muchas horas después de una comida. A medida que varían estas demandas y condiciones celulares, también deben hacerlo las cantidades y la funcionalidad de las diferentes enzimas.

Dado que las velocidades de las reacciones bioquímicas están controladas por la energía de activación, y las enzimas reducen y determinan las energías de activación para las reacciones químicas, las cantidades relativas y el funcionamiento de la variedad de enzimas dentro de una célula determinan en última instancia qué reacciones procederán y a qué velocidades. Esta determinación está estrictamente controlada en las células. En ciertos entornos celulares, la actividad enzimática está parcialmente controlada por factores ambientales como el pH, la temperatura, la concentración de sal y, en algunos casos, los cofactores o coenzimas.

Las enzimas también pueden regularse de manera que promuevan o reduzcan la actividad enzimática. Hay muchos tipos de moléculas que inhiben o promueven la función enzimática y varios mecanismos mediante los cuales lo hacen. In some cases of enzyme inhibition, an inhibitor molecule is similar enough to a substrate that it can bind to the active site and simply block the substrate from binding. When this happens, the enzyme is inhibited through competitive inhibition , because an inhibitor molecule competes with the substrate for binding to the active site.

On the other hand, in noncompetitive inhibition , an inhibitor molecule binds to the enzyme in a location other than the active site, called an allosteric site, but still manages to prevent substrate binding to the active site. Some inhibitor molecules bind to enzymes in a location where their binding induces a conformational change that reduces the enzyme activity as it no longer effectively catalyzes the conversion of the substrate to product. This type of inhibition is called allosteric inhibition (Figure 4.9). Most allosterically regulated enzymes are made up of more than one polypeptide, meaning that they have more than one protein subunit. When an allosteric inhibitor binds to a region on an enzyme, all active sites on the protein subunits are changed slightly such that they bind their substrates with less efficiency. There are allosteric activators as well as inhibitors. Allosteric activators bind to locations on an enzyme away from the active site, inducing a conformational change that increases the affinity of the enzyme’s active site(s) for its substrate(s) (Figure 4.9).

Career Connection

Pharmaceutical Drug Developer

Enzymes are key components of metabolic pathways. Understanding how enzymes work and how they can be regulated are key principles behind the development of many of the pharmaceutical drugs on the market today. Biologists working in this field collaborate with other scientists to design drugs (Figure 4.10).

Consider statins for example—statins is the name given to one class of drugs that can reduce cholesterol levels. These compounds are inhibitors of the enzyme HMG-CoA reductase, which is the enzyme that synthesizes cholesterol from lipids in the body. By inhibiting this enzyme, the level of cholesterol synthesized in the body can be reduced. Similarly, acetaminophen, popularly marketed under the brand name Tylenol, is an inhibitor of the enzyme cyclooxygenase. While it is used to provide relief from fever and inflammation (pain), its mechanism of action is still not completely understood.

How are drugs discovered? One of the biggest challenges in drug discovery is identifying a drug target. A drug target is a molecule that is literally the target of the drug. In the case of statins, HMG-CoA reductase is the drug target. Drug targets are identified through painstaking research in the laboratory. Identifying the target alone is not enough scientists also need to know how the target acts inside the cell and which reactions go awry in the case of disease. Once the target and the pathway are identified, then the actual process of drug design begins. In this stage, chemists and biologists work together to design and synthesize molecules that can block or activate a particular reaction. However, this is only the beginning: If and when a drug prototype is successful in performing its function, then it is subjected to many tests from in vitro experiments to clinical trials before it can get approval from the U.S. Food and Drug Administration to be on the market.

Many enzymes do not work optimally, or even at all, unless bound to other specific non-protein helper molecules. They may bond either temporarily through ionic or hydrogen bonds, or permanently through stronger covalent bonds. Binding to these molecules promotes optimal shape and function of their respective enzymes. Two examples of these types of helper molecules are cofactors and coenzymes. Cofactors are inorganic ions such as ions of iron and magnesium. Coenzymes are organic helper molecules, those with a basic atomic structure made up of carbon and hydrogen. Like enzymes, these molecules participate in reactions without being changed themselves and are ultimately recycled and reused. Vitamins are the source of coenzymes. Some vitamins are the precursors of coenzymes and others act directly as coenzymes. Vitamin C is a direct coenzyme for multiple enzymes that take part in building the important connective tissue, collagen. Therefore, enzyme function is, in part, regulated by the abundance of various cofactors and coenzymes, which may be supplied by an organism’s diet or, in some cases, produced by the organism.

Feedback Inhibition in Metabolic Pathways

Molecules can regulate enzyme function in many ways. The major question remains, however: What are these molecules and where do they come from? Some are cofactors and coenzymes, as you have learned. What other molecules in the cell provide enzymatic regulation such as allosteric modulation, and competitive and non-competitive inhibition? Perhaps the most relevant sources of regulatory molecules, with respect to enzymatic cellular metabolism, are the products of the cellular metabolic reactions themselves. In a most efficient and elegant way, cells have evolved to use the products of their own reactions for feedback inhibition of enzyme activity. Feedback inhibition involves the use of a reaction product to regulate its own further production (Figure 4.11). The cell responds to an abundance of the products by slowing down production during anabolic or catabolic reactions. Such reaction products may inhibit the enzymes that catalyzed their production through the mechanisms described above.

The production of both amino acids and nucleotides is controlled through feedback inhibition. Additionally, ATP is an allosteric regulator of some of the enzymes involved in the catabolic breakdown of sugar, the process that creates ATP. In this way, when ATP is in abundant supply, the cell can prevent the production of ATP. On the other hand, ADP serves as a positive allosteric regulator (an allosteric activator) for some of the same enzymes that are inhibited by ATP. Thus, when relative levels of ADP are high compared to ATP, the cell is triggered to produce more ATP through sugar catabolism.


Agradecimientos

We thank Christoph Ziegenhain for sharing the count matrix of UMI-based protocols and Keith A. Laycock and Xiaotu Ma for editing the manuscript.

Fondos

This study was also supported in part by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number P30CA021765 and by ALSAC.

Availability of data and materials

The Rh41 scRNA-seq dataset and the bulk RNA-seq data for sorted CD44 high and CD44 low subpopulations generated in this study have been deposited in GEO under the accession number GSE113660 [47]. The functions used for the data analysis are included in the NBID package under a MIT license, which can be installed from Bitbucket (https://bitbucket.org/Wenan/nbid) [48]. The source code is also uploaded with DOI URL: https://doi.org/10.5281/zenodo.1225670 [49]. The codes for data QC and DE analysis using other packages can be downloaded from https://bitbucket.org/Wenan/scrna_qc_de [50]. The public datasets we use in this paper are from Ziegenhain et al. [12], Zheng et al. [8], Grun et al. [20], Jatin et al. [21], Klein et al. [7], Islam et al. [22], and Scialdone et al. [23].


Methods

Cloning, Mutagenesis, Protein Expression, and Purification.

Subcloning of the cDNA encoding the C-terminal 614 residues of human CYPOR (residues 67-VRESSFV through 675-SLDVWS) from Mammalian Gene Collection 9411 (ATCC) into the pET-28a vector (Novagen), yielding the expression plasmid, pETPORΔ66, was previously described (14) and detailed in Métodos SI. Histidine-tagged Δ66 CYPOR proteins were expressed in the JM109(DE3) strain and purified as described previously (14) and described in Métodos SI. FAD and FMN contents of each CYPOR protein were determined by extracting flavins from samples by boiling and subjecting the supernatant to HPLC as described in Métodos SI.

Kinetic Analysis, Circular Dichroism Spectroscopic Analysis, and Limited Trypsin Digestion.

Detailed description of these experimental procedures is available in Métodos SI.

Crystallization, Data Collection, and Structure Determination.

All crystals were grown using the hanging drop vapor diffusion method (25) at 19 °C, followed by the macroseeding technique (26), as detailed in Métodos SI. All datasets were collected at the Structural Biology Center-CAT 19ID beamline at the Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, and were processed using HKL 2000 (27). All crystals of the Δ66 proteins belong to the orthorhombic space group, PAG212121, with approximate unit cell dimensions of a = 70 Å, B = 118 Å, y C = 115 Å with two molecules in an asymmetric unit. In all cases, the initial structures were solved by the molecular replacement method using Molrep in the CCP4 program package (28) with the structure of the corresponding domains of wild-type rat CYPOR structure (17) (Protein Data Bank ID 1AMO). Subsequent refinements of the initial structures were carried out using the CNS program package (29). The final data collection and refinement statistics are summarized in Table S1.


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