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¿Cómo afecta el fármaco MBC a la despolimerización de los microtúbulos en las células eucariotas?


Intenté buscar el mecanismo de cómo el metil bencimidazol-2-il-carbamato afecta a los microtúbulos en eucariotas, pero lo que encontré no fue muy útil:

  1. Quilan et al 1980 afirman que actúa inhibiendo la polimerización de los microtúbulos en lugar de despolimerizarlos directamente.
  2. En "El citoesqueleto: un objetivo para los agentes tóxicos", se menciona que

… Las cepas de Aspergillus que eran resistentes al fármaco tenían una menor afinidad por el MBC en un ensayo de unión, mientras que las cepas supersensibles tenían una mayor afinidad por el fármaco.

Se agradecería cualquier referencia.

En resumen: Me gustaría saber cómo el fármaco MBC afecta la despolimerización de los microtúbulos en las células eucariotas. También agradecería cualquier referencia científica.


La carbendazim inhibe la polimerización de los microtúbulos al unirse directamente a la tubulina, evitando que las subunidades interactúen. Por lo tanto, el huso mitótico se deforma y potencialmente causa aneuploidía en las células afectadas. A menudo se muestra que los mecanismos de resistencia son cambios en la permeabilidad de la membrana al compuesto.


CARBENDAZIM (anexo)


Una vista ampliada del citoesqueleto eucariota

Una rica y continua historia de investigación en biología celular ha definido los principales sistemas de polímeros del citoesqueleto eucariota. Estudios recientes han identificado proteínas adicionales que forman estructuras filamentosas en las células y pueden autoensamblarse en polímeros lineales cuando se purifican. Esto sugiere que el citoesqueleto eucariota es un sistema aún más complejo de lo que se consideró anteriormente. En este ensayo, examino el caso de una definición ampliada del citoesqueleto eucariota y presento una serie de desafíos para el trabajo futuro en esta área.


INTRODUCCIÓN

La criomicroscopía electrónica (crio-EM) es una familia de métodos que se utiliza para estudiar la estructura biológica, desde los átomos hasta las células. Para preservar los detalles moleculares de una muestra biológica, la muestra crio-EM se mantiene libre de la fijación química, deshidratación y tinción de metales pesados ​​que se utilizan comúnmente en la EM tradicional. Además, la muestra se congela tan rápidamente que las moléculas de agua quedan inmovilizadas en un estado amorfo, lo que mantiene el material biológico "hidratado". Una vez congelada, la muestra debe mantenerse a menos de -135 ° C antes y durante la adquisición de imágenes en un criomicroscopio electrónico de transmisión. Debido a que el haz de electrones del microscopio daña rápidamente la materia biológica, las imágenes crio-EM se obtienen utilizando una dosis de electrones muy limitada. Las imágenes de baja dosis resultantes son ruidosas y, por lo tanto, requieren un procesamiento e interpretación cuidadosos. Estos estrictos requisitos garantizan que los datos crio-EM representen estructuras biológicas en un estado realista mínimamente perturbado.

Dos formas populares de crio-EM son el análisis de “partículas únicas” (SPA) y la criotomografía electrónica (crio-ET). Los biólogos estructurales han utilizado estos dos enfoques para estudiar los complejos macromoleculares, aquí llamados complejos por brevedad. SPA ha revolucionado la determinación de la estructura de complejos purificados. Debido a que este método puede producir rutinariamente mapas de densidad 3-D en los que se resuelven las cadenas laterales de proteínas, SPA es un reemplazo popular para los estudios de cristalografía de rayos X de complejos mayores de ∼100 kDa. Por el contrario, cryo-ET es un método que genera modestos mapas de densidad en 3D con una resolución de ∼40 Å de complejos, orgánulos e incluso células. Si se identifican varias copias de un complejo, se pueden analizar mediante un promedio de subtomogramas (STA). STA implica alinear y promediar múltiples copias del mismo complejo, aumentando así la relación señal-ruido y suprimiendo los artefactos de cuña faltante (que se detallan más adelante), lo que da como resultado mapas de mayor resolución (Asano et al., 2016 Oikonomou y Jensen, 2017 Hutchings y Zanetti, 2018 Schur, 2019).

Esta perspectiva está escrita para biólogos celulares que estén interesados ​​en aprender y aplicar crio-ET a sus sistemas eucariotas favoritos. Para cubrir una amplia gama de ideas, hemos omitido algunos detalles técnicos, que se encuentran en otra literatura y recursos de capacitación en línea (Henderson, 1995 Koster et al., 1997 Frank, 2006a, b Dubochet, 2007 Penczek, 2010 Shen e Iwasa, 2018 Vos y Jensen, 2018 Rodenburg, 2019). Discutimos algunos principios no intuitivos de cryo-ET y nuestras expectativas de las tecnologías actuales y futuras. También revisamos algunos estudios que utilizan muestras artificialmente delgadas como criosecciones y criolamelas porque tales muestras amplían enormemente la gama de preguntas que se pueden hacer. Finalmente, exploramos cómo se puede utilizar la crio-ET para estudiar grandes máquinas celulares que desafían los enfoques convencionales.


Contenido

El primer compuesto conocido que se une a la tubulina fue la colchicina, se aisló del azafrán de otoño, Colchicum autumnale, pero no se ha utilizado para el tratamiento del cáncer. Los primeros medicamentos contra el cáncer aprobados para uso clínico fueron los alcaloides de la vinca, la vinblastina y la vincristina en la década de 1960. Fueron aislados de extractos de hojas del Catharanthus roseus (Vinca rosea) en la Universidad de Western Ontario en 1958. [1] El primer fármaco pertenece a los taxanos y al paclitaxel, descubierto en extractos de la corteza del tejo, Taxus brevifolia, en 1967 por Monroe Wall y Mansukh Wani, pero su actividad inhibidora de la tubulina no se conoció hasta 1979. Los tejos son una fuente pobre de agentes activos que limitaron el desarrollo de taxanos durante más de 20 años hasta que se descubrió la forma de síntesis. [1] En diciembre de 1992 se aprobó el uso de paclitaxel en quimioterapia. [2]

Función Editar

Los microtúbulos son los componentes clave del citoesqueleto de las células eucariotas y tienen un papel importante en diversas funciones celulares, como la migración y el transporte intracelulares, el mantenimiento de la forma celular, la polaridad, la señalización celular y la mitosis. [3] Desempeñan un papel fundamental en la división celular al participar en el movimiento y la unión de los cromosomas durante varias etapas de la mitosis. Por lo tanto, la dinámica de los microtúbulos es un objetivo importante para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. [1]

Estructura Editar

Los microtúbulos están compuestos por dos subunidades de proteínas globulares, α y β-tubulina. Estas dos subunidades se combinan para formar un α, β-heterodímero que luego se ensambla en una estructura en forma de tubo filamentoso. Los heterodímeros de tubulina se organizan de cabeza a cola con la subunidad α de un dímero entrando en contacto con la subunidad β del otro. Esta disposición da como resultado la formación de largas fibras proteicas llamadas protofilamentos. Estos protofilamentos forman la columna vertebral del microtúbulo cilíndrico hueco que tiene aproximadamente 25 nanómetros de diámetro y varía de 200 nanómetros a 25 micrómetros de longitud. Aproximadamente 12-13 protofilamentos se colocan en paralelo para formar una lámina de proteína en forma de C, que luego se enrolla para dar una estructura similar a una tubería llamada microtúbulo. La disposición de la cabeza a la cola de los heterodímeros da polaridad al microtúbulo resultante, que tiene una subunidad α en un extremo y una subunidad β en el otro extremo. El extremo de la α-tubulina tiene cargas negativas (-) mientras que el extremo de la β-tubulina tiene cargas positivas (+). [3] El microtúbulo crece a partir de sitios de ensamblaje discretos en las células llamadas centros de organización de microtúbulos (MTOC), que son una red de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP). [4] [5]

Dos moléculas de guanosina trifosfato rico en energía (GTP) también son componentes importantes de la estructura de los microtúbulos. Una molécula de GTP está estrechamente unida a la α-tubulina y no es intercambiable, mientras que la otra molécula de GTP está unida a la β-tubulina y puede intercambiarse fácilmente con difosfato de guanosina (GDP). La estabilidad del microtúbulo dependerá de si el extremo β está ocupado por GTP o GDP. Un microtúbulo que tiene una molécula de GTP en el extremo β será estable y continuará creciendo, mientras que un microtúbulo que tenga una molécula de GDP en el extremo β será inestable y se despolimerizará rápidamente. [4] [5]

Dinámica de microtúbulos Editar

Los microtúbulos no son estáticos, pero son polímeros altamente dinámicos y exhiben dos tipos de comportamientos dinámicos: "inestabilidad dinámica" y "andar en cinta". La inestabilidad dinámica es un proceso en el que los extremos de los microtúbulos cambian entre períodos de crecimiento y acortamiento. Los dos extremos no son iguales, el extremo anillado (-) de α-tubulina es menos dinámico mientras que el extremo anillado (+) de β-tubulina más dinámico crece y se acorta más rápidamente. El microtúbulo sufre largos períodos de lento alargamiento, breves períodos de rápido acortamiento y también una pausa en la que no hay crecimiento ni acortamiento. [3] [5] [6] La inestabilidad dinámica se caracteriza por cuatro variables: la tasa de crecimiento de los microtúbulos, la tasa de acortamiento, la frecuencia de transición del crecimiento o estado de pausa al acortamiento (llamado "catástrofe") y la frecuencia de transición de acortamiento al crecimiento o pausa (llamado "rescate"). El otro comportamiento dinámico llamado caminadora es el crecimiento neto de los microtúbulos en un extremo y el acortamiento neto en el otro extremo. Implica el flujo intrínseco de subunidades de tubulina desde el extremo positivo hasta el extremo negativo. Ambos comportamientos dinámicos son importantes y un microtúbulo en particular puede exhibir principalmente inestabilidad dinámica, andar en cinta o una mezcla de ambos. [6] [7]

Los agentes que actúan como inhibidores de la tubulina también actúan como inhibidores de la división celular. Un microtúbulo existe en un estado dinámico continuo de crecimiento y acortamiento por asociación reversible y disociación de heterodímeros de α / β-tubulina en ambos extremos. Este comportamiento dinámico y el control resultante sobre la longitud del microtúbulo es vital para el correcto funcionamiento del huso mitótico en la mitosis, es decir, la división celular.

El microtúbulo está involucrado en diferentes etapas del ciclo celular. Durante la primera etapa o profase, los microtúbulos necesarios para la división celular comienzan a formarse y crecer hacia los cromosomas recién formados formando un paquete de microtúbulos llamado huso mitótico. Durante la prometafase y la metafase, este huso se adhiere a los cromosomas en un punto particular llamado cinetocoro y experimenta varios períodos de crecimiento y acortamiento en sintonía con las oscilaciones hacia adelante y hacia atrás de los cromosomas. También en la anafase, los microtúbulos unidos a los cromosomas mantienen un proceso de alargamiento y acortamiento cuidadosamente regulado. Por tanto, la presencia de un fármaco que pueda suprimir la dinámica de los microtúbulos es suficiente para bloquear el ciclo celular y provocar la muerte de las células por apoptosis. [1] [8] [9]

Por tanto, los inhibidores de la tubulina actúan interfiriendo con la dinámica de los microtúbulos, es decir, creciendo (polimerización) y acortándose (despolimerización). Una clase de inhibidores actúa inhibiendo la polimerización de la tubulina para formar microtúbulos y se denominan inhibidores de la polimerización como los análogos de la colchicina y los alcaloides de la vinca. Disminuyen la masa de polímero de microtúbulos en las células a alta concentración y actúan como agentes desestabilizadores de microtúbulos. La otra clase de inhibidores actúa inhibiendo la despolimerización de la tubulina polimerizada y aumenta la masa de polímero de microtúbulos en las células. Actúan como agentes estabilizadores de microtúbulos y se denominan inhibidores de la despolimerización como los análogos de paclitaxel. [3] Estas tres clases de fármacos parecen funcionar mediante un mecanismo ligeramente diferente.

Los análogos de colchicina bloquean la división celular al alterar los microtúbulos. Se ha informado que la subunidad β de la tubulina participa en la unión de colchicina. Se une a la tubulina soluble para formar el complejo colchicina-tubulina. Este complejo, junto con las tubulinas normales, se polimeriza para formar el microtúbulo. Sin embargo, la presencia de este complejo T-C evita una mayor polimerización del microtúbulo. Este complejo provoca un cambio conformacional que bloquea los dímeros de tubulina para que no se agreguen más y, por lo tanto, evita el crecimiento de los microtúbulos. A medida que el complejo T-C ralentiza la adición de nuevos dímeros, el microtúbulo se desmonta debido a un desequilibrio estructural o inestabilidad durante la metafase de la mitosis. [11]

Los alcaloides de Vinca se unen a la subunidad β de los dímeros de tubulina en una región distinta llamada dominio de unión a Vinca. Se unen rápidamente a la tubulina y esta unión es reversible e independiente de la temperatura (entre 0 ° C y 37 ° C). A diferencia de la colchicina, los alcaloides de la vinca se unen directamente a los microtúbulos. En primer lugar, no forman un complejo con la tubulina soluble ni se copolimerizan para formar el microtúbulo, sin embargo, son capaces de provocar un cambio conformacional en la tubulina en relación con la autoasociación de tubulina. [6] Los alcaloides de la vinca se unen a la tubulina con alta afinidad en los extremos de los microtúbulos, pero con baja afinidad en los sitios de tubulina presentes a lo largo de los lados del cilindro de microtúbulos. La unión de estos fármacos en los sitios de alta afinidad da como resultado una fuerte supresión cinética del intercambio de tubulina incluso a baja concentración de fármaco, mientras que su unión a los sitios de baja afinidad en concentraciones de fármaco relativamente alta despolimeriza los microtúbulos. [1]

A diferencia de la colchicina y los alcaloides de la vinca, el paclitaxel mejora la polimerización de los microtúbulos promoviendo las fases de nucleación y elongación de la reacción de polimerización y reduce la concentración crítica de subunidades de tubulina (es decir, la concentración de tubulina soluble en estado estacionario). Los microtúbulos polimerizados en presencia de paclitaxel son extremadamente estables. [1] El mecanismo de unión del paclitaxel imita al del nucleótido GTP junto con algunas diferencias importantes. GTP se une en un extremo del dímero de tubulina manteniendo contacto con el siguiente dímero a lo largo de cada uno de los protofilamentos mientras que el paclitaxel se une a un lado de la β-tubulina manteniendo contacto con el siguiente protofilamento. El GTP se une a los dímeros de tubulina no ensamblados, mientras que los sitios de unión del paclitaxel se encuentran solo en la tubulina ensamblada. La hidrólisis de GTP permite el desmontaje y la regulación del sistema de microtúbulos, sin embargo, la activación de la tubulina por el paclitaxel da como resultado la estabilización permanente del microtúbulo. Por tanto, se describió que la supresión de la dinámica de los microtúbulos es la principal causa de la inhibición de la división celular y de la muerte de las células tumorales en las células tratadas con paclitaxel. [12]

Las moléculas de unión a tubulina han ganado mucho interés entre los agentes citotóxicos debido a su éxito en oncología clínica. Se diferencian de los otros medicamentos contra el cáncer en su modo de acción porque se dirigen al huso mitótico y no al ADN. Los fármacos que se unen a la tubulina se han clasificado sobre la base de su modo de acción y sitio de unión [4] [13] [14] como:

I. Inhibidores de la despolimerización de tubulina Editar

a) Ligandos del sitio de paclitaxel, incluye paclitaxel, epotilona, ​​docetaxel, discodermolida, etc.

II. Inhibidores de la polimerización de tubulina Editar

a) Sitio de unión de colchicina, incluye colchicina, combrestatina, 2-metoxiestradiol, metoxibencenosulfonamidas (E7010), etc.

b) Sitio de unión de los alcaloides de la vinca, [15] incluye vinblastina, vincristina, vinorelbina, vinflunina, dolastatinas, halicondrinas, hemiasterlinas, criptofisina 52, etc.

Vinblastina unida a tubulina.

Colchicina unida a tubulina.

    y vincristina se aislaron del bígaro de Madagascar Catharanthus roseus. Madagascar usó tradicionalmente la vinca rosea para tratar la diabetes. De hecho, se ha utilizado durante siglos en todo el mundo para tratar todo tipo de dolencias, desde picaduras de avispas en la India hasta infecciones oculares en el Caribe. En la década de 1950, los investigadores comenzaron a analizar la planta y descubrieron que contenía más de 70 alcaloides. Se encontró que algunos tienen efecto sobre los niveles más bajos de azúcar en sangre y otros actúan como hemostáticos. Lo más interesante fue que se descubrió que la vinblastina y la vincristina reducían la cantidad de glóbulos blancos en la sangre. Un alto número de glóbulos blancos en la sangre indica leucemia, por lo que se ha descubierto un nuevo fármaco contra el cáncer. Estos dos alcaloides se unen a la tubulina para evitar que la célula produzca los husos que necesita para poder dividirse. Esto es diferente de la acción del taxol que interfiere con la división celular al evitar que los husos se rompan. La vinblastina es principalmente útil para tratar el linfoma de Hodgkin, el cáncer de testículo avanzado y el cáncer de mama avanzado. La vincristina se usa principalmente para tratar la leucemia aguda y otros linfomas. fue desarrollado bajo la dirección del farmacéutico francés Pierre Poiter, quien, en 1989, obtuvo una licencia inicial para la excavación bajo la marca Navelbine. La vinorelbina también se conoce como tartrato de vinorelbina, el fármaco es un análogo semisintético de otro fármaco para combatir el cáncer, la vinblastina. La vinorelbina se incluye en la clase de fármacos conocidos como alcaloides de la vinca y muchas de sus características imitan la química y los mecanismos biológicos de los fármacos citotóxicos vincristina y vinblastina. La vinorelbina mostró una actividad prometedora contra el cáncer de mama y se encuentra en ensayo clínico para el tratamiento de otros tipos de tumores. es un nuevo alcaloide de la vinca fluorada que se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase II, que en estudios preclínicos mostró una actividad antitumoral superior a la vinorelbina y la vinblastina. La vinflunina bloquea la mitosis en la transición metafase / anafase, lo que conduce a la apoptosis. [17] La ​​vinflunina es un fármaco de quimioterapia que se usa para tratar el cáncer avanzado de vejiga de células de transición y del tracto urotelial. También se llama Javlor. Está autorizado para personas que ya han recibido quimioterapia con cisplatino o carboplatino. 52 fue aislado de las algas verde azuladasNostoc sp. GSV 224. Las criptoficinas son una familia de depsipéptidos relacionados que muestran una actividad citotóxica muy potente. La criptoficina 52 se desarrolló originalmente como fungicida, pero era demasiado tóxica para uso clínico. Posteriormente, la investigación se centró en tratar la criptoficina como un veneno de microtúbulos, evitando la formación del huso mitótico. [10] La criptoficina 52 mostró una potente actividad antimitótica para resistir la dinámica de los microtúbulos del huso. [4] Asimismo, el interés en este fármaco ha surgido aún más por el descubrimiento de que la criptoficina muestra una susceptibilidad reducida a la bomba de resistencia a múltiples fármacos y no muestra reducción de actividad en una serie de líneas celulares resistentes a fármacos. fue aislado por primera vez de Halichondria okadai, y más tarde de las esponjas no relacionadas Axinella carteri y Phankella carteri. La halicondrina B es un macrólido poliéter complejo que se sintetiza y detiene el crecimiento celular a concentraciones subnanomolares. [4] La halicondrina B es un inhibidor no competitivo de la unión de la vincristina y la vinblastina a la tubulina, lo que sugiere que los fármacos se unen al sitio de unión de la vinca o un sitio cercano.El aislamiento de la halicondrina B proviene de dos géneros no relacionados de esponjas, lo que ha llevado a especular que la halicondrina B es un microbiano en realidad, en lugar de un metabolito de esponja porque las esponjas soportan una amplia gama de microbios. Si este es el caso, las tecnologías de fermentación podrían proporcionar un suministro útil de halicondrina B.
  • Las dolastatinas se aislaron de la liebre marina.Dolabella auricularia, un pequeño molusco marino, y se cree que es la fuente del veneno utilizado para asesinar al hijo del emperador Claudio de Roma en el 55 d.C. Las dolastatinas 10 y 15 son nuevos pentapéptidos y exhiben poderosas propiedades antimitóticas. Son citotóxicos en varias líneas celulares a concentraciones subnanomolares. Los péptidos de las dolastatinas 10 y 15 inhiben de forma no competitiva la unión de vincristina a tubulina. La dolastatina 10 es 9 veces más potente que la dolastatina 15 y ambas son más potentes que la vinblastina. [4] Las dolastatinas también mejoran y estabilizan la unión de la colchicina a la tubulina.
  • Se aislaron hemiasterlinas de la esponja marina, Cymbastela sp. Las hemiasterlinas son una familia de péptidos citotóxicos potentes. La hemiasterlina A y la hemiasterlina B muestran una potente actividad contra la línea celular P388 e inhiben la división celular al unirse al sitio del alcaloide de la vinca en la tubulina. La hemiasterlina A y B exhiben actividades antiproliferativas más fuertes que los alcaloides de la vinca y el paclitaxel. un alcaloide preparado a partir de los granos secos y las semillas del azafrán de la pradera, Colchicum autumnale, es un fármaco antiinflamatorio que se ha utilizado de forma continua durante más de 3000 años. La colchicina es un fármaco oral que se utiliza para tratar la gota aguda y prevenir los ataques agudos de fiebre mediterránea familiar (FMF). Sin embargo, el uso de colchicina está limitado por su alta toxicidad en otras terapias. Se sabe que la colchicina inhibe la división y proliferación celular. Los primeros estudios demostraron que la colchicina altera el huso mitótico. Posteriormente se demostró que la disolución de los microtúbulos es responsable del efecto de la colchicina sobre el huso mitótico y la proliferación celular. [18] está aislado del sauce sudafricano, Combretum caffrum. La combretastatina es uno de los compuestos más simples que muestra efectos antimitóticos por interacción con el sitio de unión de colchicina de la tubulina, y también es uno de los inhibidores más potentes de la unión de colchicina. [4] La combretastatina no es reconocida por la bomba de resistencia a múltiples fármacos (MDR), una bomba celular que expulsa rápidamente moléculas extrañas de la célula. [8] También se informa que la combretastatina puede inhibir la angiogénesis, un proceso esencial para el crecimiento tumoral. Excepto esos factores, una de las desventajas de la combretastatina es la baja solubilidad en agua.
  • E7010 es el agente antimitótico de sulfonamida más activo, que se ha demostrado que inhibe la formación de microtúbulos al unirse en el sitio de las colchicinas. [4] [8] Es bastante soluble en agua como sal ácida. La metoxibencenosulfonamida mostró buenos resultados contra una amplia gama de células tumorales, incluidos los tumores sólidos resistentes a los alcaloides de la vinca. Los resultados de los estudios en animales indicaron actividad contra tejidos de cáncer colorrectal, de mama y de pulmón. es un metabolito natural de la hormona estradiol de los mamíferos y se forma por oxidación en el hígado. El 2-metoxiestradiol es citotóxico para varias líneas de células tumorales, se une al sitio de colchicina de la tubulina, induciendo la formación de microtúbulos anormales. El 2-metoxiestradiol exhibe una potente actividad apoptótica contra las células tumorales de rápido crecimiento. También tiene actividad antiangiogénica a través de un efecto apoptótico directo sobre las células endoteliales. [19], es un análogo semisintético del paclitaxel, con el nombre comercial Taxotere. El docetaxel tiene las modificaciones de estructura mínimas en la cadena lateral de C13 y la sustitución de C10 mostró más solubilidad en agua y más potencia que el paclitaxel. Los ensayos clínicos han demostrado que los pacientes que desarrollan hipersensibilidad al paclitaxel pueden recibir docetaxel sin una respuesta alérgica. [4] fue aislado de la corteza del tejo del Pacífico Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae). Más tarde, también se aisló de los avellanos (hojas, ramitas y nueces) y los hongos que viven en estos árboles, pero la concentración es solo alrededor del 10% de la concentración en los tejos. El paclitaxel también se conoce como Taxol y Onxol por ser un fármaco contra el cáncer. El fármaco es el tratamiento de primera línea para el cáncer de ovario, mama, pulmón y colon y el tratamiento de segunda línea para el sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA. (El sarcoma de Kaposi es un cáncer de piel y membranas mucosas que se encuentra comúnmente en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA). Es tan eficaz que algunos oncólogos se refieren al período anterior a 1994 como la era "anterior al taxol" para el tratamiento del cáncer de mama. [20] se derivan de una bacteria del suelo en fermentación, Sorangium cellulosum y se encontró que era demasiado tóxico para su uso como antifúngico. Las epotilonas son agentes estabilizadores de microtúbulos con un mecanismo de acción similar a los taxanos, incluida la supresión de la dinámica de los microtúbulos, la estabilización de los microtúbulos, la promoción de la polimerización de la tubulina y el aumento de la masa del polímero a altas concentraciones. Inducen detención mitótica en la fase G2-M del ciclo celular, lo que resulta en apoptosis. [1] La epotilona A y la epotilona B exhiben propiedades antifúngicas y citotóxicas. Estas epotilonas son inhibidores competitivos de la unión del paclitaxel a la tubulina y presentan una actividad a concentraciones similares. Este hallazgo lleva a suponer que las epotilonas y el paclitaxel adoptan conformaciones similares in vivo. Sin embargo, las epotilonas son aproximadamente 30 veces más solubles en agua que el paclitaxel y están más disponibles, se obtienen fácilmente por fermentación de la mixobacteria original y podrían prepararse mediante síntesis total. Las epotilonas también muestran no ser reconocidas por mecanismos de resistencia a múltiples fármacos, por lo tanto, tiene una potencia mucho mayor que el paclitaxel en líneas celulares resistentes a múltiples fármacos. [8] inicialmente se encontró que tenía actividades inmunosupresoras y antifúngicas. Discodermolida es un producto marino de alquetetraeno lactona polihidroxilada, aislado de la esponja de aguas profundas de las Bahamas, Discodermia disoluta, inhibió la mitosis celular e indujo la formación de polímero de tubulina estable in vitro y se consideró más eficaz que el paclitaxel con un valor de CE50 de 3,0 μM frente a 23 μM. [4] El fármaco, un macrólido (lactona polihidroxilada), es miembro de una clase estructural diversa de compuestos llamados policétidos con un notable mecanismo de acción químico. Estabiliza los microtúbulos de las células diana, esencialmente deteniéndolos en una etapa específica del ciclo celular y deteniendo la división celular. Es un candidato de origen marino prometedor para el tratamiento de ciertos cánceres.

Colchicina es uno de los fármacos antimitóticos más antiguos que se conocen y en los últimos años [ ¿Cuándo? ] Se han realizado muchas investigaciones para aislar o desarrollar compuestos que tengan una estructura similar pero una alta actividad y menos toxicidad. Esto resultó en el descubrimiento de varios análogos de colchicina. La estructura de la colchicina está formada por tres anillos, un anillo trimetoxibenceno (anillo A), un anillo metoxitropona (anillo C) y un anillo de siete miembros (anillo B) con un grupo acetamido ubicado en su posición C-7. El grupo trimetoxifenilo de la colchicina no solo ayuda a estabilizar el complejo de tubulina-colchicina, sino que también es importante para la actividad antitubulina junto con el anillo C. El grupo 3-metoxi aumentó la capacidad de unión, mientras que el grupo 1-metoxi ayudó a lograr la correcta conformación de la molécula. La estabilidad del anillo de tropona y la posición del grupo metoxi y carbonilo son cruciales para la capacidad de unión del compuesto. El grupo 10-metoxi se puede reemplazar con grupos halógeno, alquilo, alcoxi o amino sin afectar la afinidad de unión a tubulina, mientras que los sustituyentes voluminosos reducen la actividad. Cuando el anillo B se expandió mostró una actividad reducida, sin embargo, se cree que el anillo y su cadena lateral C-7 afectan la conformación de los análogos de colchicina en lugar de su capacidad de unión a tubulina. La sustitución en C-5 dio como resultado la pérdida de actividad, mientras que la unión de los sistemas de anillos heterocíclicos anulados al anillo B dio como resultado un compuesto muy potente. [11]

Paclitaxel ha logrado un gran éxito como fármaco contra el cáncer, sin embargo, se ha realizado un esfuerzo continuo para mejorar su eficacia y desarrollar análogos que sean más activos y tengan mayor biodisponibilidad y especificidad. La importancia de la cadena lateral de fenilisoserina sustituida en C-13 para la bioactividad del paclitaxel se conoce desde hace mucho tiempo. Se han probado varios reemplazos en la sustitución C-3 '. El reemplazo del grupo fenilo C-3 'con grupos alquilo o alquinilo mejoró en gran medida la actividad, y con el grupo CF3 en esa posición en combinación con la modificación del 10-Ac con otros grupos acilo aumentó la actividad varias veces. También se encontró que era potente otra modificación de C-3 'con restos de ciclopropano y epóxido. Se encontró que la mayoría de los análogos sin anillo A eran mucho menos activos que el propio paclitaxel. Los análogos con cadena lateral amida en C-13 son menos activos que su contraparte éster. También la desoxigenación en la posición 1 mostró una actividad reducida. La preparación de 10-α-espiro-epóxido y su éter 7-MOM dio compuestos que tenían citotoxicidad y actividad de ensamblaje de tubulina comparables a las del paclitaxel. La sustitución con C-6-α-OH y C-6-β-OH dio análogos que eran equipotentes al paclitaxel en el ensayo de ensamblaje de tubulina. Finalmente, se encuentra que el anillo de oxetano juega un papel importante durante la interacción con la tubulina. [21]

Vinblastina es un fármaco muy potente que también tiene efectos secundarios graves, especialmente en el sistema neurológico. Por tanto, se desarrollaron nuevos análogos sintéticos con el objetivo de obtener fármacos más eficientes y menos tóxicos. Las configuraciones estereoquímicas en C-20 ', C-16' y C-14 'en la porción de velbanamina son críticas y la inversión conduce a la pérdida de actividad. El grupo carboximetilo C-16 'es importante para la actividad ya que el dímero descarboxilado es inactivo. La variación estructural en C-15'- C-20 'en el anillo de velbanamina se tolera bien. La modificación del esqueleto superior de vinblastina dio vinorelbina que muestra una actividad comparable a la de vinblastina. Otro análogo preparado fue el derivado difluoro de vinorelbina que mostró una actividad antitumoral in vivo mejorada. Se descubrió que la fluoración en la posición C-19 'de la vinorelbina aumentaba drásticamente la actividad in vivo. La mayoría de los estudios de SAR involucran la porción de vindolina de los alcaloides bis-indol porque la modificación en C-16 y C-17 ofrece buenas oportunidades para desarrollar nuevos análogos. El reemplazo del grupo éster con un grupo amida en el C-16 resultó en el desarrollo de vindesina. De manera similar, el reemplazo del grupo acetilo en C-16 con L-trp-OC2H5, d-Ala (P) - (OC2H5) 2, L-Ala (P) - (OC2H5) 2 e I-Vla (P) - (OC2H5) ) 2 dieron lugar a nuevos análogos que tenían actividad anti-tubulina. También se encontró que el grupo metilo indol de la vindolina es una posición útil para funcionalizar potencialmente y desarrollar nuevos y potentes derivados de la vinblastina. Una nueva serie de C-16-espiro-oxazolidina-1,3-dionas semisintéticas preparadas a partir de 17-desacetilvinblastina mostró una buena actividad anti-tubulina y menor citotoxicidad. El vinglicinato, un profármaco de glicinato derivado del grupo C-17-OH de la vinblastina, mostró una actividad antitumoral y una toxicidad similares a las de la vinblastina. [22]

Efectos secundarios Editar

    , un hormigueo progresivo, duradero, a menudo irreversible, un dolor intenso y una hipersensibilidad al frío, que comienza en las manos y los pies y, a veces, involucra los brazos y las piernas. [23]
  • estomatitis (ulceración de los labios, lengua, cavidad oral)
  • náuseas, vómitos, diarrea, estreñimiento, íleo paralítico, retención urinaria
  • supresión de la médula ósea: enrojecimiento, reacciones cutáneas localizadas, erupción cutánea (con o sin) prurito, opresión en el pecho, dolor de espalda, disnea, fiebre por fármacos o escalofríos
  • efectos musculoesqueléticos: artralgia y / o mialgia
  • severa debilidad
  • hipotension
  • alopecia [24]

Factores humanos Editar

Las limitaciones en la terapia contra el cáncer se deben principalmente a dos razones, debido al organismo del paciente, o debido a las alteraciones genéticas específicas en las células tumorales. En el paciente, la terapia está limitada por la mala absorción de un fármaco que puede conducir a una baja concentración del agente activo en la sangre y una pequeña cantidad de suministro al tumor. El bajo nivel sérico de un fármaco también puede deberse a un metabolismo y una excreción rápidos asociados con la afinidad por el citocromo P450 intestinal o hepático. Otra razón es la inestabilidad y degradación de los fármacos en el medio gastrointestinal. El problema grave es también la variabilidad entre pacientes, lo que provoca una biodisponibilidad diferente después de la administración de una dosis igual de un fármaco y una tolerancia diferente al efecto de los agentes de quimioterapia. El segundo problema es particularmente importante en el tratamiento de las personas mayores. Su cuerpo es más débil y necesita aplicar dosis más bajas, a menudo por debajo del nivel terapéutico. Otro problema con los agentes anticancerosos es su limitada solubilidad en agua, lo que reduce sustancialmente la absorción de un fármaco. Los problemas con la administración de dosis al tumor ocurren también cuando el agente activo tiene un peso molecular alto que limita la penetración en el tejido o el tumor tiene un gran volumen que impide la penetración. [3] [25]

Resistencia a los medicamentos Editar

La resistencia a múltiples fármacos es la limitación más importante en la terapia contra el cáncer. Puede desarrollarse en muchos compuestos químicamente distintos. Hasta ahora, se conocen varios mecanismos para desarrollar la resistencia. La más común es la producción de las llamadas "bombas de salida". Las bombas eliminan los fármacos de las células tumorales que conducen a una concentración baja del fármaco en el objetivo, por debajo del nivel terapéutico. El reflujo es causado por la glicoproteína P, también llamada transportador de múltiples fármacos. Esta proteína es un producto del gen MDR1 de resistencia a múltiples fármacos y un miembro de la familia de transportadores dependientes de ATP (casete de unión a ATP). La glicoproteína P se encuentra en todos los organismos y sirve para proteger al cuerpo de los xenobióticos y participa en el movimiento de nutrientes y otros compuestos biológicamente importantes dentro de una célula o entre células. La glicoproteína P detecta sustratos cuando entran en la membrana plasmática y se unen a ellos, lo que provoca la activación de uno de los dominios de unión de ATP. El siguiente paso es la hidrólisis de ATP, que conduce a un cambio en la forma de la P-gp y abre un canal a través del cual se bombea el fármaco fuera de la célula. La hidrólisis de una segunda molécula de ATP da como resultado el cierre del canal y el ciclo se repite. La glicoproteína P tiene afinidad por los fármacos hidrófobos con carga positiva o eléctricamente neutra y, a menudo, se sobreexpresa en muchos cánceres humanos. Algunos tumores, p. Ej. cáncer de pulmón, no sobreexpresan este transportador pero también son capaces de desarrollar la resistencia. Se descubrió que otro transportador MRP1 también funciona como bomba de eflujo, pero en este caso los sustratos son compuestos naturales cargados negativamente o fármacos modificados por glutatión, conjugación, glicosilación, sulfatación y glucuronilación. Las drogas pueden ingresar a una célula de varias formas. Las rutas principales son: difusión a través de la membrana plasmática, a través del receptor o transportador o por el proceso de endocitosis. El cáncer puede desarrollar la resistencia por mutaciones en sus células que resultan en alteraciones en la superficie de las células o en endocitosis alterada. La mutación puede eliminar o cambiar transportadores o receptores, lo que permite que los fármacos entren en la célula tumoral. Otra causa de resistencia a los fármacos es una mutación en la tubulina β que causa alteraciones en los sitios de unión y un fármaco determinado no puede unirse a su objetivo. Los tumores también cambian las isoformas de expresión de la tubulina para estos, que no son objetivos de los fármacos antimitóticos, p. sobreexpresa βIII-tubulina. Además, las células tumorales expresan otros tipos de proteínas y cambian la dinámica de los microtúbulos para contrarrestar el efecto de los medicamentos contra el cáncer. La resistencia a los medicamentos también puede desarrollarse debido a la interrupción de la terapia. [3] [5] [6] [25]

Otros Editar

  • Eficacia clínica marginal: a menudo los compuestos muestran actividad in vitro pero no tienen actividad antitumoral en la clínica. [26]
  • La escasa solubilidad en agua de los medicamentos que deben disolverse en aceite de ricino polioxietilado o polisorbato causa reacciones de hipersensibilidad. Se ha sugerido que estos disolventes también pueden reducir el suministro de fármacos a las células diana. [10] [27]
  • Límite de biodisponibilidad [28]: las dosis más altas causan una alta toxicidad y el uso a largo plazo conduce a neurotoxicidad acumulativa y toxicidad hematopoyética. [10]
  • La neuropatía, que es un efecto secundario significativo, puede desarrollarse en cualquier momento de la terapia y requerir una interrupción del tratamiento. Una vez que los síntomas se han resuelto, la terapia puede reiniciarse, pero la ruptura permite que el tumor desarrolle resistencia. [dieciséis]
  • Poca penetración a través de la barrera hematoencefálica. [dieciséis]

Debido a los numerosos efectos adversos y las limitaciones de uso, se necesitan nuevos fármacos con mejores propiedades. Especialmente son las mejoras deseadas en la actividad antitumoral, el perfil de toxicidad, la formulación del fármaco y la farmacología. [27] Actualmente se han sugerido pocos enfoques en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos con mejores propiedades.


RESULTADOS

Rotación y translocación del núcleo

El núcleo del fibroblasto Swiss 3T3 exhibe un movimiento mejorado cuando se trata con monensina (Paddock y Albrecht-Buehler, 1986) o con flujo de cizallamiento mecánico (Tseng et al., 2004). Utilizando microscopía de contraste de fase de lapso de tiempo y una cámara de flujo de placas paralelas, documentamos el movimiento del núcleo dentro del citoplasma de un solo fibroblasto Swiss 3T3 cortado (figura 1A y película complementaria 1). La aplicación de flujo de cizallamiento provocó un desplazamiento menor de las células, pero indujo grandes desviaciones del núcleo con respecto al resto de la célula (Figura 1B). Para cuantificar el movimiento y la forma del núcleo, se monitorearon los siguientes parámetros dinámicos y morfométricos. Primero, medimos la translocación del núcleo dentro del citoplasma, δ, normalizado por el radio equivalente del núcleo (Figura 1C y Materiales y métodos). En segundo lugar, los cambios en las interdistancias, λ, entre los centroides del núcleo y cada nucleolo se midieron como se describió anteriormente (Tseng et al., 2004) para monitorear los cambios en la integridad intranuclear (Figura 1D). En tercer lugar, se calcularon los cambios en el factor de forma del núcleo, σ, para medir posibles deformaciones en la envoltura nuclear (Figura 1D). Finalmente, el grado de rotación nuclear (NR), θ, se cuantificó mediante el seguimiento de los desplazamientos de centroide de cada nucleolo con respecto a la posición del centroide del núcleo (Figura 1D y Materiales y métodos).

Figura 1. El esfuerzo cortante mecánico externo mejora los movimientos del cuerpo rígido del núcleo en los fibroblastos suizos 3T3. (A) Secuencia de contraste de fase de lapso de tiempo de un fibroblasto Swiss 3T3 sometido a flujo de cizallamiento durante 40 min (esfuerzo de cizallamiento 9,4 din / cm 2). En el primer cuadro, el círculo rojo sólido indica la posición inicial y la forma del núcleo.Como referencia, los círculos rojos punteados subsiguientes marcan la posición inicial del núcleo. Los círculos verdes indican la posición instantánea y la forma del núcleo. Barra, 20 μm. (B) Desplazamiento neto del núcleo (corregido por el desplazamiento celular) en el fibroblasto cizallado que se muestra en A, utilizando coordenadas dependientes del tiempo del centroide del núcleo (xnorte, ynorte) y el centroide de la celda (xC, yC). (C) Translocación de núcleo normalizada (δ) de células cortadas (•, n = 7) y células de control no cortadas (○, n = 5). (D) Esquema para el cálculo del factor de forma del núcleo σ (utilizando tanto el área aparente, A, como el perímetro, P, del núcleo), la interdistancia núcleo-nucleolo λ y la rotación del núcleo θ. Tanto λ como θ se calculan utilizando las posiciones del centroide del núcleo y los nucléolos, como lo indican los puntos blancos (ver Materiales y métodos). (E) Cambios en el factor de forma del núcleo σ y las interdistancias núcleo-nucleolo λ normalizadas por sus respectivos valores iniciales, σo y λoy distribución de la rotación del núcleo (θ) en los fibroblastos cortados de control (n = 7).

En las células cortadas (n = 7), los valores de δ fueron aproximadamente dos veces más altos que en las células no cortadas (n = 5, Figura 1C) después de 40 min de flujo de corte y los núcleos de las células cortadas se movieron ∼40% de sus radios equivalentes (Figura 1C ). Tanto la forma del núcleo (σ) como la organización intranuclear (λ) permanecieron casi intactas durante el transcurso del experimento, es decir, el núcleo de las células cortadas mostró un movimiento mejorado sin cambiar de forma (Figura 1E y Película complementaria 1). Denotamos este tipo de movimiento, movimiento de “cuerpo rígido”. En los primeros tiempos, aproximadamente una cuarta parte de los pares núcleo-nucleolo exhibieron al menos una rotación de 15 ° (barras blancas y grises en la Figura 1E). Sin embargo, tal NR cesó después de 10 min de flujo de cizallamiento (barras negras y rojas en la Figura 1E). Debido a que los valores de λ y σ fueron constantes durante la rotación, describimos este comportamiento como rotación concertada del núcleo.

La despolimerización de F-actina no afecta significativamente el movimiento del núcleo

Para investigar los mecanismos que subyacen al movimiento del núcleo del cuerpo rígido, primero examinamos las contribuciones de estructuras citoesqueléticas importantes bien conocidas, es decir, F-actina y MT. La estructura de F-actina se despolimerizó en fibroblastos Swiss 3T3 usando concentraciones variables de LA-B antes del flujo de cizallamiento (Figura 2A). La inmunofluorescencia de la estructura del filamento de actina reveló una despolimerización extensa en la región de laminillas para todas las concentraciones de LA-B probadas, pero las estructuras de F-actina alrededor del núcleo no fueron reemplazadas por completo por pequeños agregados de actina hasta que LA-B alcanzó una concentración de 1.6 μM (Figura 2A) . A esta concentración, los fibroblastos exhibieron una morfología típica tratada con LA-B (Bershadsky et al., 1995), pero las celdas estaban demasiado débilmente ancladas al sustrato para resistir los flujos de cizallamiento durante un período de tiempo prolongado. Este fue también el caso de las células tratadas con LA-B 630 nM, aunque las células fueron adherentes durante 25 min de flujo de cizallamiento. Todos los núcleos de células cizalladas tratadas con LA-B 630 nM o menos (n = 10) exhibieron movimientos similares a los de las células de control (datos no publicados). A 315 nM de LA-B, las células (n = 3) se adhirieron durante al menos 40 minutos y continuaron mostrando movimientos de núcleos de cuerpo rígido. La gráfica de los valores de δ mostró que la translocación del núcleo no se vio afectada por el tratamiento con LA-B (Figura 2B). La microscopía de fluorescencia de células tratadas con LA-B 315 nM reveló estructuras menores de actina F cerca de los núcleos, mientras que la mayor parte de la actina F se despolimerizó en la laminilla y la región perinuclear (Figura 2A). Por lo tanto, la F-actina no puede descartarse por completo como un contribuyente al movimiento coordinado del núcleo debido a las estructuras residuales menores de la F-actina que quedan debido a la naturaleza de nuestro ensayo. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que la despolimerización significativa de F-actina no afecta el movimiento del cuerpo rígido en fibroblastos suizos 3T3 bajo estrés mecánico.

Figura 2. El tratamiento celular con el agente despolimerizante de actina F, latrunculina-B, no produce cambios en el movimiento del núcleo. (A) Organización de F-actina en fibroblastos Swiss 3T3 tratados con concentraciones variables de agente despolimerizante de F-actina, latrunculina-B (LA-B), durante 30 min. La F-actina y el ADN nuclear se visualizaron usando Alexa-488 phallodin y DAPI, respectivamente. La despolimerización de F-actina en la región perinuclear es evidente para todas las concentraciones de LA-B probadas. No se produjo una despolimerización significativa de F-actina en la laminilla hasta 315 nM. Barra, 20 μm. (B) Translocación normalizada del centroide del núcleo de células de control cortadas (negro, n = 7) y fibroblastos tratados con LA-B (315 nM, amarillo, n = 3).

La alteración de la MT afecta la morfología del núcleo y elimina la NR de cuerpo rígido

A continuación, investigamos el efecto de la integridad de la MT sobre el movimiento del núcleo debido a su abundancia en las células, especialmente alrededor del núcleo (Lane y Allan, 1998). Las células se trataron con el agente disruptor de MT nocodazol durante 30 min antes del cizallamiento (n = 3). Las células mostraron tinción MT manchada sin MTOC distintivo (Figura 3A), mientras que conservaban una red de F-actina intacta (Figura 3A, recuadro). La microscopía de contraste de fase reveló un núcleo muy dúctil (Figura 3B y Película complementaria 6). Los valores dependientes del tiempo de σ y λ ya no estaban en su mayoría dentro del 5% de su valor inicial (Figura 3C). Por lo tanto, sin una estructura MT intacta que rodee el núcleo, no solo se compromete la rigidez de la envoltura nuclear, sino que los movimientos de los nucléolos dentro del núcleo también se vuelven independientes entre sí. La distribución de la rotación de los pares núcleo-nucleolo también fue más amplia que en las células de control, con algunos pares de núcleo-nucleolo girando hasta 30 ° desde su posición inicial (Figura 3C). Sin embargo, debido a que tanto σ como λ varían drásticamente, la rotación ya no puede considerarse concertada. En ausencia de cizallamiento, la translocación de los núcleos de las células tratadas con nocodazol (n = 3) fue ligeramente mayor que en las células de control (Figura 3D). En presencia de cizallamiento, los núcleos de fibroblastos tratados con nocodazolet (n = 3) exhibieron una translocación dramáticamente aumentada en comparación con las células no tratadas (Figura 3D). Sin embargo, al igual que con la rotación, dicha translocación no puede considerarse un movimiento de cuerpo rígido debido a los valores σ y λ muy variables. En contraste con la despolimerización de la F-actina, la despolimerización de MT dentro de los fibroblastos Swiss 3T3 hace que tanto la región intranuclear como la membrana nuclear se vean comprometidas, lo que conduce a un aumento de los movimientos del núcleo no concertados.

Figura 3. El movimiento del núcleo depende de la integridad de los microtúbulos. (A) Organización de MT en fibroblastos tratados durante 30 min con 1 μg / ml de nocodazol. La inmunofluorescencia de MT, ADN nuclear y F-actina mostró una estructura MT completamente despolimerizada con estructura intacta de F-actina (recuadro). (B) La secuencia de contraste de fase a intervalos de un fibroblasto cizallado tratado con nocodazol revela un núcleo muy dúctil. Los círculos de colores sólidos y discontinuos indican la posición inicial del núcleo (verde) y las posiciones iniciales de los nucléolos (cian y rojo), las flechas blancas muestran la ubicación instantánea de los nucléolos. Barra, 20 μm. (C) Cambios en el factor de forma del núcleo σ y las interdistancias núcleo-nucleolo λ, normalizados por sus respectivos valores iniciales, σo y λoy distribución de la rotación del núcleo θ en fibroblastos cortados tratados con nocodazol (n = 3). Distribuciones más amplias de σ / σo y λ / λo indican cambios en la integridad del núcleo, así como un movimiento no concertado del núcleo. (D) Izquierda: translocación del núcleo en células de control sin cortar (n = 5) y células tratadas con nocodazol (n = 3). Derecha: translocación del núcleo en células de control cortadas (n = 7) y células tratadas con nocodazol (n = 3).

La inactivación de Cdc42 provoca una NR sostenida

A continuación, investigamos, a través de la inactivación de Rho GTPasas individuales, cómo la reorganización, en lugar de la despolimerización en masa, de las estructuras citoesqueléticas afectaría el movimiento del núcleo. Se ha demostrado previamente que los miembros de la familia RhoGTPasas, RhoA, Rac1 y Cdc42, están involucrados en la reorganización de las redes de F-actina y MT (Nobes y Hall, 1995, 1999 Bishop y Hall, 2000). Se generaron construcciones de RhoGTPasas fusionadas con EGFP para confirmar la transfección positiva (Figura 4A, recuadro). En comparación con las células de control, la transfección de EGFP: Cdc42T17N (n = 5), EGFP: RhoAT19N (n = 3) o EGFP: Rac1T17N (n = 3) en fibroblastos Swiss 3T3 causó cambios menores en los valores de σ y λ ( Figura complementaria 1). Pero, la transfección de EGFP: Cdc42T17N provocó que los núcleos de los fibroblastos cortados sufrieran una NR concertada sostenida (Figuras 4B). Inicialmente (t = 5-10 min), los núcleos de las células transfectadas EGFP: Cdc42T17N mostraron un grado de rotación similar al de las células de control (Figuras 1E y 4B). Sin embargo, mientras que el núcleo de las células de control dejó de rotar después de 10 min de flujo de cizallamiento, los núcleos de fibroblastos transfectados con EGFP: Cdc42T17N continuaron rotando, con algunos de los pares núcleo-nucleolo rotando hasta 10 veces más que en las células de control ( barras negras y rojas, Figura 4B). A diferencia de las células tratadas con nocodazol, esta rotación mejorada no se incrementó artificialmente por la deformación del núcleo porque los cambios en λ y σ eran comparables a los fibroblastos de control (Figura complementaria 1). Los perfiles de translocación de núcleos en fibroblastos transfectados con EGFP: Cdc42T17N fueron dramáticamente diferentes de los de las células de control (Figuras 4D). En los primeros momentos (t & lt10 min), δ era comparable a las células de control, sin embargo, en t & gt10 min, δ aumentó bruscamente y se volvió similar a δ observado en las células tratadas con nocodazol (Figura 4D). En contraste con la transfección de Cdc42 negativo dominante, la transfección de EGFP: Rac1T17N produjo parámetros morfométricos (λ, σ) y dinámicos (θ, δ) que eran similares a los encontrados en las células de control cortadas (Figura 4, B y C). EGFP: La transfección RhoAT19N provocó un cambio en la distribución de los pares núcleo-nucleolo que rotaban en escalas de tiempo tempranas, pero no causaron ningún aumento significativo en θ o δ (Figura 4, B y C). Juntos, estos resultados sugieren que Cdc42, no RhoA o Rac1, está involucrado en la regulación tanto de la rotación como de la translocación del núcleo en fibroblastos Swiss 3T3 bajo estrés mecánico.

Figura 4. El Cdc42 negativo dominante causa una rotación sostenida del núcleo y una translocación mejorada del núcleo en los fibroblastos bajo tensión de cizallamiento. (A) Secuencia de contraste de fase de lapso de tiempo de fibroblastos cortados transfectados con EGFP: Cdc42T17N (primera fila), EGFP: RhoAT19N (segunda fila) o EGFP: Rac1T17N (tercera fila). La fluorescencia de EGFP indica que las células se transfectan positivamente (recuadro). Las líneas continuas y discontinuas muestran la posición inicial y la forma del núcleo (verde) y las flechas blancas de los nucléolos (rojo y cian) indican la ubicación instantánea de los nucléolos. Barra, 20 μm. (B) Distribución de las rotaciones del núcleo en células cizalladas transfectadas con EGFP: Cdc4217N (primera fila, n = 5), EGFP: RhoAT19N (segunda fila, n = 3) o EGFP: Rac1T17N (tercera fila, n = 3). Las distribuciones de rotación final se muestran en rojo. (C) Translocación de núcleo normalizada en células cizalladas transfectadas con EGFP: Cdc42T17N (rojo, n = 5), EGFP: RhoAT19N (amarillo, n = 3) o EGFP: Rac1T17N (verde, n = 3). (D) Comparación de la translocación de núcleo normalizada de células de control cortadas (negro, n = 7), en células tratadas con nocodazol (azul, n = 3) y células transfectadas con EGFP: Cdc42T17N (rojo, n = 5). Translocaciones de núcleos en EGFP: las células Cdc42T17N son comparables a los núcleos de control en los primeros momentos (t & lt15 min), pero se vuelven mayores después, moviéndose casi tanto como los núcleos tratados con nocodazol.

Shear Flow promueve el reposicionamiento de MTOC en fibroblastos suizos 3T3

Encontramos que bajo el flujo de cizallamiento, los cambios en la actividad de Cdc42 o en la integridad de la MT afectan significativamente el movimiento del núcleo. Curiosamente, Cdc42 y MT también juegan un papel importante en la polarización celular (Hall, 1998 Johnson, 1999 Palazzo et al., 2001 Pequeño et al., 2002 Fukata et al., 2003 Magdalena et al., 2003b). Estructuralmente, los extremos negativos de los MT se anclan en el MTOC, o el centrosoma, que se coloca muy cerca del núcleo en los fibroblastos en interfase (Lane y Allan, 1998 Magdalena et al., 2003a). Recientemente, se ha documentado en C. elegans que existe un vínculo físico entre el centrosoma y el núcleo a través de las proteínas de la familia Hook y SUN (Malone et al., 2003). Por lo tanto, especulamos que nuestro movimiento del núcleo inducido por cizallamiento observado podría ser causado por el reposicionamiento inducido por cizallamiento y la polarización del MTOC en fibroblastos suizos 3T3.

Para determinar los cambios en la polaridad celular, utilizamos un ensayo de localización de MTOC descrito anteriormente (Tzima et al., 2003). Mediante microscopía de fluorescencia de la organización MT y el ADN nuclear, determinamos las posiciones relativas del MTOC con respecto al núcleo y la dirección del flujo. Al dividir el núcleo en dos hemisferios, uno en la dirección del flujo, otro en la dirección opuesta al flujo y observando la ubicación del MTOC en relación con la línea de demarcación, la posición del MTOC se utilizó como marcador de la polaridad celular. (líneas blancas y círculos en la Figura 5A). Este ensayo de localización de MTOC estándar se llevó a cabo por primera vez en células no cortadas (n = 75), para las cuales se verificó que la distribución de la ubicación de MTOC era isotrópica, es decir, distribución 50:50 a ambos lados de la línea de demarcación (Figura 5B). Debido a que las células se transfectaron con varias construcciones que contienen EGFP, también transfectamos las células con plásmidos EGFP en blanco y verificamos que el proceso de transfección no afectó la distribución aleatoria de la ubicación de MTOC (datos no publicados). A continuación, las células se cortaron durante 40 min y se fijaron para microscopía de fluorescencia posterior. En las celdas de control cortadas (n = 75), el MTOC se localizó predominantemente en la dirección del flujo (Figura 5B). Estos resultados indican que el flujo de cizallamiento no solo mejora el movimiento del núcleo, sino que también induce el reposicionamiento de MTOC en los fibroblastos Swiss 3T3 en la dirección del flujo.

La inactivación de Cdc42, no RhoA o Rac1, inhibe la polarización de MTOC en fibroblastos cizallados

Luego investigamos si la inactivación de RhoGTPasas eliminaría la polarización inducida por cizallamiento en fibroblastos Swiss 3T3. En ausencia de cizallamiento, las células de control y las células transfectadas con EGFP: RhoAT19N, EGFP: Rac1T17N o EGFP: Cdc42T17N conservaron una distribución isotrópica del MTOC alrededor del núcleo (Figura 5B). Cuando se sometieron a flujo de cizallamiento, las células transfectadas con EGFP: RhoAT19N o EGFP: Rac1T17N continuaron exhibiendo una distribución de MTOC polarizada similar a las células de control de cizallamiento (Figura 5B). Sin embargo, la transfección de EGFP: Cdc42T17N abolió el reposicionamiento inducido por cizallamiento del MTOC en la dirección del flujo (Figura 5B).

Para garantizar que la polarización de MTOC en fibroblastos esté regulada de hecho por la vía de señalización de Cdc42, investigamos los efectores posteriores de Cdc42. En las líneas celulares MDCK y COS-7, Cdc42 forma un complejo con la proteína de partición defectuosa, Par6, y la PKC atípica de mamíferos, PKCζ (Joberty et al., 2000). Debido a que la polarización depende del complejo Cdc42-Par6-PKCζ en células endoteliales y astrocitos cizallados (Etienne-Manneville y Hall, 2001, 2003 Tzima et al., 2003 Wojciak-Stothard y Ridley, 2003), especulamos que Cdc42 mediaba la reorientación de MTOC en fibroblastos suizos 3T3 a través de interacciones similares con Par6 y PKCζ.

Se transfectaron fibroblastos Swiss 3T3 con formas tanto naturales como inactivas de Par6B y PKCζ, respectivamente. Para probar la transfección positiva, se transfectó un vector EGFP en blanco junto con los vectores Par6B y PKCζ en una proporción de 1:10 (Tzima et al., 2003). Las células que muestran la transfección positiva de los vectores Par6B y PKCζ mostraron una fluorescencia verde similar a las células transfectadas con RhoGTPasas fusionadas con EGFP (Figura 5A). Las transfecciones de Par6B y PKCζ de tipo salvaje conservaron una distribución uniforme de MTOC cuando las células no se cortaron y una distribución de MTOC polarizada cuando las células se cortaron (Figura 5B). Por lo tanto, las transfecciones de Par6B y PKCζ de tipo salvaje no alteraron la respuesta de las células polarizadas por el flujo de cizallamiento. Sin embargo, las células transfectadas con PKCζ inactiva de quinasa abolieron la polarización de MTOC inducida por cizallamiento (Figura 5B). Se obtuvieron los mismos resultados para ΔNt Par6B (Figura 5B). Juntos, estos resultados sugieren que la inactivación de Cdc42, pero no de RhoA o Rac1, anula la polarización de MTOC inducida por cizallamiento en fibroblastos Swiss 3T3. Además, incluso si Cdc42 está activo, sin Par6B o PKCζ normal con los que interactuar, la señal no se puede propagar aguas abajo de Cdc42 para promover el reposicionamiento de MTOC en células cortadas.


Polimerización de microtúbulos

Nucleación

La nucleación es el evento que inicia la formación de microtúbulos a partir del dímero de tubulina. Los microtúbulos suelen estar nucleados y organizados por orgánulos llamados centros organizadores de microtúbulos (MTOC). Dentro del MTOC hay otro tipo de tubulina, γ-tubulina, que es distinta de las subunidades α y β de los propios microtúbulos. La γ-tubulina se combina con varias otras proteínas asociadas para formar una estructura similar a una arandela de seguridad conocida como "complejo de anillo de γ-tubulina" (γ-TuRC). Este complejo actúa como plantilla para que los dímeros de α / β-tubulina comiencen la polimerización; actúa como una tapa del extremo (-) mientras que el crecimiento de los microtúbulos continúa alejándose del MTOC en la dirección (+).

El centrosoma es el MTOC primario de la mayoría de los tipos de células. Sin embargo, los microtúbulos también pueden nuclearse desde otros sitios. Por ejemplo, los cilios y los flagelos tienen MTOC en su base denominados cuerpos basales. Además, el trabajo del grupo Kaverina en Vanderbilt, así como otros, sugiere que el aparato de Golgi puede servir como una plataforma importante para la nucleación de microtúbulos. Debido a que la nucleación del centrosoma es inherentemente simétrica, la nucleación de microtúbulos asociada a Golgi puede permitir que la célula establezca asimetría en la red de microtúbulos. En estudios recientes, el grupo Vale en UCSF identificó el complejo proteico augmina como un factor crítico para la generación de microtúbulos basada en huso dependiente del centrosoma. Se ha demostrado que interactúa con γ-TuRC y aumenta la densidad de microtúbulos alrededor del origen del huso mitótico.

Algunos tipos de células, como las células vegetales, no contienen MTOC bien definidos. En estas células, los microtúbulos se nuclean a partir de sitios discretos en el citoplasma. Otros tipos de células, como los parásitos tripanosomátidos, tienen un MTOC pero se encuentra permanentemente en la base de un flagelo. Aquí, la nucleación de microtúbulos para roles estructurales y para la generación del huso mitótico no es de un MTOC canónico similar al centríolo.

Polimerización

Después del evento de nucleación inicial, se deben agregar monómeros de tubulina al polímero en crecimiento.El proceso de adición o eliminación de monómeros depende de la concentración de dímeros de αβ-tubulina en solución en relación con la concentración crítica, que es la concentración de dímeros en estado estacionario en la que ya no hay ensamblaje o desensamblaje neto al final del microtúbulo. . Si la concentración de dímero es mayor que la concentración crítica, el microtúbulo se polimerizará y crecerá. Si la concentración es menor que la concentración crítica, la longitud del microtúbulo disminuirá.


Expresiones de gratitud

Subvención de apoyo: Sociedad Danesa del Cáncer (M. Jäättelä), la Fundación Nacional de Investigación Danesa (M. Jäättelä), el Consejo Danés de Investigación Médica (J. Nylandsted y M. Jäättelä), la Fundación Meyer (M. Jäättelä), la Fundación Novo Nordisk (M .Høyer-Hansen), la Fundación Vilhelm Pedersen (J. Nylandsted y M. Jäättelä) y la Fundación Danesa para la Investigación del Cáncer (M. Jäättelä).

Los costos de publicación de este artículo fueron sufragados en parte por el pago de cargos por página. Por lo tanto, este artículo debe estar marcado anuncio publicitario de acuerdo con 18 U.S.C. Sección 1734 únicamente para indicar este hecho.

Agradecemos a Ingrid Fossar Larsen por su excelente asistencia técnica y a Jiri Bartek, Anthony Cerami, Guido Kroemer, Beth Levine y Christian Thomsen por sus invaluables herramientas de investigación.


Resultados

Activación de nuevos sitios de crecimiento independientemente de la replicación del ADN.

En las células de tipo salvaje que crecen exponencialmente, solo se activa un nuevo sitio de crecimiento por ciclo celular, temprano en G2. Durante mucho tiempo se ha entendido que la activación de una nueva zona de crecimiento requiere que se complete la replicación del ADN y un tamaño celular mínimo (Mitchison y Nurse, 1985), pero hay alguna evidencia (Rupes et al., 1999) que sugiere que el potencial para activar el crecimiento está presente durante todo el ciclo celular. Para probar más esta posibilidad, verificamos si se podría activar más de una zona de crecimiento por ciclo celular. Usamos el mutante del ciclo celular sensible a la temperatura, cdc25-22, que a la temperatura restrictiva (36,5 ° C) se bloquea en G2 dando lugar a células alargadas con distribución de actina bipolar. Después de 3 horas a 36,5ºC, las células se trataron con 50 µg / ml de metil-2-bencimidazol-carbamato (MBC) para despolimerizar los microtúbulos (panel inferior de la Fig. 1A). Después de 4 horas en MBC, alrededor del 80% de estas células se ramificaron (Fig. 1A, B, panel superior). Como se muestra en la Fig. 1B, solo se detectaron pequeños trozos de tubulina en estas células. Se detectó acumulación de actina en el medio celular cuando la rama comenzó a formarse, y se encontró que los tres extremos de las células ramificadas tenían parches de actina y por lo tanto estaban creciendo activamente (Fig. 1C). El crecimiento en todos los extremos se confirmó mediante tinción con calcofluor (Fig. 1C). Uso de películas de lapso de tiempo de tratadas con MBC cdc25-22 células a la temperatura restrictiva estimamos que la longitud celular promedio en la ramificación era de 31 μm, aproximadamente el doble del tamaño de una célula de levadura de fisión bipolar antes de la mitosis. Estos resultados se confirmaron utilizando otro mutante del ciclo celular, cdc2-33, la mayoría de las cuales se bloquean temprano en G2. En las mismas condiciones experimentales descritas para cdc25-22, El 70% de cdc2-33 las células se ramificaron después del tratamiento con MBC mientras que sólo el 4% lo hizo en las células de control tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) (datos no mostrados). Por lo tanto, las células bipolares alargadas pueden activar una tercera zona de crecimiento, lo que indica que el establecimiento de nuevos sitios de crecimiento puede ocurrir en las células G2 en ausencia de más rondas de replicación del ADN.

Activación de nuevas zonas de crecimiento en células bipolares G2. (A) Células ramificadas durante cdc25-22 cuadra. Las células se bloquearon a 36,5ºC durante 1, 2 y 3 horas, antes de la adición de MBC / DMSO (la longitud del bloque antes de la adición de MBC / DMSO se muestra entre paréntesis en el gráfico). Las flechas negras indican el momento del tratamiento farmacológico. El porcentaje de células ramificadas es un promedio de tres experimentos (a menos que se indique lo contrario) con s.e.m. valores inferiores al 5%. Se contaron 100-200 células en cada momento. (B) Imágenes de campo claro de células bloqueadas (3 horas) tratadas durante 3 horas con DMSO (arriba a la izquierda) o con 50 μg / ml de MBC (paneles superior derecho e inferior). Tinción con anticuerpo TAT-1 de células tratadas con MBC, tratadas como anteriormente (abajo). (C) Cdc25-22 células bloqueadas (3 horas) tratadas con DMSO (izquierda), MBC durante 1 hora (centro) y durante 3 horas (derecha), teñidas para actina (panel superior), con DAPI (panel central) y con calcofluor (panel inferior). (D) Fotogramas de película de cdc25-22 cdc13-YFP cepas bloqueadas a 36,5 ° C durante 3 horas y luego tratadas con MBC a t= 0, al inicio del lapso de tiempo. Los fotogramas se tomaron cada 10 minutos, utilizando un microscopio Axioplan Zeiss. Barras, 5 μm.

Activación de nuevas zonas de crecimiento en células bipolares G2. (A) Células ramificadas durante cdc25-22 cuadra. Las células se bloquearon a 36,5ºC durante 1, 2 y 3 horas, antes de la adición de MBC / DMSO (la longitud del bloque antes de la adición de MBC / DMSO se muestra entre paréntesis en el gráfico). Las flechas negras indican el momento del tratamiento farmacológico. El porcentaje de células ramificadas es un promedio de tres experimentos (a menos que se indique lo contrario) con s.e.m. valores inferiores al 5%. Se contaron 100-200 células en cada momento. (B) Imágenes de campo claro de células bloqueadas (3 horas) tratadas durante 3 horas con DMSO (arriba a la izquierda) o con 50 μg / ml de MBC (paneles superior derecho e inferior). Tinción con anticuerpo TAT-1 de células tratadas con MBC, tratadas como anteriormente (abajo). (C) Cdc25-22 células bloqueadas (3 horas) tratadas con DMSO (izquierda), MBC durante 1 hora (centro) y durante 3 horas (derecha), teñidas para actina (panel superior), con DAPI (panel central) y con calcofluor (panel inferior). (D) Fotogramas de película de cdc25-22 cdc13-YFP cepas bloqueadas a 36,5 ° C durante 3 horas y luego tratadas con MBC a t= 0, al inicio del lapso de tiempo. Los fotogramas se tomaron cada 10 minutos, utilizando un microscopio Axioplan Zeiss. Barras, 5 μm.

Para confirmar que la replicación del ADN no es necesaria para la activación del crecimiento, generamos células G1 bipolares utilizando el doble mutante cdc10-129 cdc11-119. A 36,5 ° C, cdc10-129 cdc11-119 las células experimentan una ronda de mitosis sin tabicación y, como consecuencia, se bloquean en G1 y permanecen bipolares. Después de la adición de MBC, el 70% de las células se ramificaron en comparación con sólo el 7% en las células tratadas con DMSO (Fig. 2A, B). Concluimos que la activación de una nueva zona de crecimiento es independiente de la replicación del ADN y de la etapa del ciclo celular.

Requisito mínimo de tamaño de celda para la activación de una nueva zona de crecimiento

A continuación, probamos si las células deben tener una longitud mínima para activar una zona de crecimiento adicional. Se obtuvieron poblaciones de células de diferente longitud celular promedio bloqueando el cdc25-22 colar durante diferentes períodos de tiempo (1, 2, 3, 4, 5 horas) antes de la adición de MBC. Como se muestra en la Fig.1A, el 50% de las células se ramificaron de 5 a 6 horas después de que se impuso el bloqueo del ciclo celular, independientemente del momento de la adición de MBC, que no inhibe la extensión de la longitud celular (Sawin y Snaith, 2004), lo que indica que la longitud celular es limitante para la activación de una zona de crecimiento adicional. También probamos la eficiencia de ramificación en células monopolares agregando MBC a bloqueado cdc10-129 células. Como se muestra en la Fig. 2B, solo el 13% de las células tenían un fenotipo ramificado después de 5 horas en MBC, lo que indica que las células monopolares no se ramifican de forma eficaz. Para investigar esto más a fondo, examinamos si un aumento en el tamaño de la célula monopolar daría como resultado un aumento en la eficiencia de ramificación. Comparamos las células de tamaño normal con las bloqueadas. cdc25-22 células que habían sido incubadas a la temperatura restrictiva para duplicar su tamaño. Las últimas células se liberaron luego a la temperatura permisiva de 25 ° C en presencia del inhibidor de la síntesis de ADN hidroxiurea (HU), que bloquea las células en la fase S temprana antes de la transición de NETO. Noventa minutos después de la liberación, las células se trataron con MBC o DMSO. Después de 3 horas de tratamiento con MBC, el 25% de las células tenía una nueva zona de crecimiento en el medio. Por el contrario, sólo el 4% de las células de control de tamaño normal activaron una nueva zona de crecimiento en su centro (Fig. 2C). En conjunto, estas observaciones indican que, en ausencia de microtúbulos, se puede activar una nueva zona de crecimiento en el medio de la célula, pero solo una vez que la célula ha alcanzado una longitud mínima crítica.

Activación de nuevas zonas de crecimiento en células detenidas en fase G1 y S. (A) Imágenes de cdc10-129 cdc11-119 Células a 36,5 ° C, después del tratamiento con 50 μg / ml de MBC durante 3 horas: Nomarski (arriba) y teñidas con DAPI (abajo). (B) Puntuación de la ramificación cdc10-129 y cdc10-129 cdc11-119 células. Ambos cdc10-129 y cdc10-129 cdc11-119 las células se bloquearon durante 3 horas antes del tratamiento con MBC. La flecha negra indica la adición de fármaco. (C) Puntuación de la ramificación cdc25-22 células. Las células se bloquearon durante 3 horas a la temperatura restrictiva para bloquear las células en G2 antes de la mitosis. Después de 3 horas, las células se liberaron a la temperatura permisiva (25ºC) para permitir la mitosis en presencia de HU 12 mM para evitar que prosiguiera la fase S. Después de 1,5 horas, se añadió DMSO / MBC al medio. El efecto de la temperatura y el tratamiento con HU se controló utilizando una cepa de tipo salvaje. Ambos tratamientos no tuvieron ningún efecto sobre las células de tipo salvaje (datos no mostrados). (D) Puntuación de células monopolares y bipolares en cdc25-22 células bloqueadas a 36,5 ° C y luego liberadas a 25 ° C en 12 mM HU. Barras, 5 μm.

Activación de nuevas zonas de crecimiento en células detenidas en fase G1 y S. (A) Imágenes de cdc10-129 cdc11-119 Células a 36,5 ° C, después del tratamiento con 50 μg / ml de MBC durante 3 horas: Nomarski (arriba) y teñidas con DAPI (abajo). (B) Puntuación de la ramificación cdc10-129 y cdc10-129 cdc11-119 células. Ambos cdc10-129 y cdc10-129 cdc11-119 las células se bloquearon durante 3 horas antes del tratamiento con MBC. La flecha negra indica la adición de fármaco. (C) Puntuación de la ramificación cdc25-22 células. Las células se bloquearon durante 3 horas a la temperatura restrictiva para bloquear las células en G2 antes de la mitosis. Después de 3 horas, las células se liberaron a la temperatura permisiva (25ºC) para permitir la mitosis en presencia de HU 12 mM para evitar que prosiguiera la fase S. Después de 1,5 horas, se añadió DMSO / MBC al medio. El efecto de la temperatura y el tratamiento con HU se controló utilizando una cepa de tipo salvaje. Ambos tratamientos no tuvieron ningún efecto sobre las células de tipo salvaje (datos no mostrados). (D) Puntuación de células monopolares y bipolares en cdc25-22 células bloqueadas a 36,5 ° C y luego liberadas a 25 ° C en 12 mM HU. Barras, 5 μm.

Si es necesaria una distancia mínima de una zona de crecimiento para activar el crecimiento, en las células monopolares el sitio preferencial para la activación del crecimiento debería estar en el nuevo extremo, opuesto a la zona que ya está creciendo. Por lo tanto, razonamos que en las células monopolares pre-alargadas la activación del crecimiento en el nuevo extremo podría tener lugar antes de que se completara la fase S. Por lo tanto, repetimos el experimento descrito anteriormente, dejando de lado el tratamiento con MBC. los cdc25-22 las células se bloquearon durante 3 horas a 36,5 ° C y luego se cambiaron a temperatura permisiva (25 ° C) en presencia de 12 mM HU. Después de 1 hora en HU, el 80% de las células se sometieron a septación, y después de 3 horas, cuando las células todavía estaban bloqueadas en la fase S temprana (no se muestran los datos de FACS), el 90% de las células tenían parches de actina en ambos extremos (Fig. 2D), lo que indica que habían activado el crecimiento en el nuevo extremo antes de la finalización de la fase S. Para medir el tamaño celular en NETO en ausencia de replicación del ADN, repetimos el experimento anterior, variando la longitud del bloque antes del cambio hacia abajo y el tratamiento con HU. En estas condiciones, estimamos que el tamaño celular promedio en NETO en ausencia de replicación del ADN fue de 17.2 μm, aproximadamente un 25% más largo que una célula mitótica de tipo salvaje (ver material suplementario Fig. S1).

Llegamos a la conclusión de que se puede activar un nuevo sitio de crecimiento independientemente de la finalización de la fase S y que el nuevo sitio de crecimiento se activa preferentemente en el nuevo extremo, que está más alejado del antiguo extremo de crecimiento activo.

El núcleo posiciona nuevos sitios de crecimiento en ausencia de microtúbulos

Cuando los microtúbulos se despolimerizan en células por encima del tamaño crítico, la nueva zona de crecimiento se coloca en el medio de la célula. Tinción DAPI en cdc25-22 (Fig. 1C) y cdc10-129 cdc11-119 (Fig. 2A) Las células tratadas con MBC mostraron que la rama siempre estaba colocada en las proximidades del núcleo. Para confirmar esta correlación entre la posición nuclear y la ubicación de la nueva zona de crecimiento, realizamos películas de lapso de tiempo de cdc25-22 células que portan Cdc13 marcado con proteína amarilla fluorescente (YFP) para marcar el núcleo (Decottignies et al., 2001). Las células se bloquearon a la temperatura restrictiva y se filmaron después de la adición de MBC. Como se muestra en la Fig. 1D, la rama se formó en el área de la célula que recubre el núcleo.

Los núcleos determinan la posición de las ramas. (A) Cuantificación de la distancia entre núcleo y rama en individuos cdc25-22-Células bloqueadas 4 horas después de la centrifugación en presencia de MBC (negro) o sin centrifugación (gris). Se midieron 82 células. Tinción DAPI de ramificaciones cdc25-22-células bloqueadas en MBC después de la centrifugación (panel inferior). (B) Puntuación de la ramificación en cdc25-22- y cdc25-22 mto1Células Δ-bloqueadas en presencia de DMSO o MBC. Antes del tratamiento, las células se bloquearon durante 3 horas a 36,5 ° C. (C) Ramificación cdc11-119 células tratadas con DMSO o MBC durante un transcurso de tiempo de 5 horas. Las células se bloquearon a la temperatura restrictiva durante 4 horas antes del tratamiento con el fármaco. (D) Imágenes de DAPI- (arriba) y actina (abajo) teñidas cdc11-119 células bloqueadas a 36,5 ° C durante 4 horas y luego tratadas con MBC durante 6 horas. Barra, 5 μm.

Los núcleos determinan la posición de las ramas. (A) Cuantificación de la distancia entre núcleo y rama en individuos cdc25-22-Células bloqueadas 4 horas después de la centrifugación en presencia de MBC (negro) o sin centrifugación (gris). Se midieron 82 células. Tinción DAPI de ramificaciones cdc25-22-células bloqueadas en MBC después de la centrifugación (panel inferior). (B) Puntuación de la ramificación en cdc25-22- y cdc25-22 mto1Células Δ-bloqueadas en presencia de DMSO o MBC. Antes del tratamiento, las células se bloquearon durante 3 horas a 36,5 ° C. (C) Ramificación cdc11-119 células tratadas con DMSO o MBC durante un transcurso de tiempo de 5 horas. Las células se bloquearon a la temperatura restrictiva durante 4 horas antes del tratamiento con el fármaco. (D) Imágenes de DAPI- (arriba) y actina (abajo) teñidas cdc11-119 células bloqueadas a 36,5 ° C durante 4 horas y luego tratadas con MBC durante 6 horas. Barra, 5 μm.

Para confirmar que el posicionamiento de este nuevo sitio de crecimiento está dirigido por el núcleo en lugar de por el centro geométrico de la célula, generamos células con núcleos mal colocados por centrifugación. Cdc25-22 las células se bloquearon durante 3 horas a temperatura restrictiva y luego se centrifugaron en presencia de 50 µg / ml de MBC a 36 ° C, para alejar el núcleo del centro celular. Se siguió la formación de ramas durante 4 horas. La posición del núcleo se evaluó mediante tinción DAPI y la distancia entre el centro del núcleo y el centro de la rama se midió en células individuales. El núcleo se desplazó del centro en más del 80% de las células (el desplazamiento medio del núcleo fue de aproximadamente 4,5 µm). Como se muestra en la Fig. 3A, en el 77% de estas células, la posición nuclear desplazada y la posición de la rama estaban separadas por menos de 2 µm. Estas observaciones apoyan aún más el papel del núcleo en el posicionamiento de los sitios de crecimiento cuando se despolimerizan los microtúbulos. Como el tratamiento con MBC deja pequeños tallos de tubulina en la vecindad del núcleo (Fig. 1B), no pudimos excluir un papel de esos tallos en el establecimiento del crecimiento polarizado. Para evaluar esta posibilidad, realizamos el mismo experimento en un cdc25-22 mto1Δ fondo. Mto1 promueve la nucleación de microtúbulos nocentrosómicos y en mto1La nucleación de microtúbulos de las células Δ está muy deteriorada y no hay presentes centros de nucleación de microtúbulos en interfase (iMTOC) (Sawin et al., 2004). Como se muestra en la Fig.3B, la eficiencia de ramificación de cdc25-22 mto1Δ células en MBC fue comparable a la de cdc25-22 células a lo largo del transcurso del tiempo, lo que sugiere que el establecimiento del crecimiento polarizado es independiente de los microtúbulos. En mto1Δ células el núcleo está descentrado (Sawin et al., 2004) y en cdc25-22 mto1En las células Δ la rama también estaba descentrada junto con el núcleo (datos no mostrados).

Luego probamos si la presencia de múltiples núcleos hacía que las células fueran competentes para activar múltiples sitios de crecimiento. Usamos el cdc11-119 mutante, que a la temperatura restrictiva sufre mitosis sin que intervenga citocinesis dando lugar a células multinucleadas. Después de 4 horas a la temperatura restrictiva, la mayoría cdc11-119 las células tienen cuatro núcleos. Después de que se añadió MBC, las células se ramificaron de manera muy eficiente durante 2 horas en MBC, el 80% de las células tenía una rama y a las 4 horas el 85% de las células tenía al menos dos ramas (Fig. 3C), y algunas células tenían de cuatro a seis ramas. Todas estas ramas estaban en la vecindad de los núcleos (Fig. 3D) y la tinción con actina mostró que todas estaban creciendo activamente (Fig. 3D). Además, analizamos la formación de ramas en células con diferentes números de núcleos agregando MBC a cdc11-119 células bloqueadas durante 0, 2 y 4 horas, generando poblaciones con un promedio de 1, 1,6 y 3,8 núcleos por célula, respectivamente. Después de 4 horas a la temperatura restrictiva en presencia de MBC, se observó una fuerte correlación entre el número de núcleos y el número de ramas (ver material suplementario Fig. S2A). Como el contenido de ADN también aumenta igualmente en cdc11-119-células bloqueadas, verificamos la ramificación en una cepa de desconexión cdc13. Tras la degradación de cdc13, las células replican su ADN sin que intervenga la mitosis, dando lugar a células poliploides con un núcleo agrandado. A pesar del contenido aumentado de ADN, solo se observó una rama tras el tratamiento con MBC (ver material suplementario Fig. S2B).

Tea1 se acumula en el medio de la célula en ausencia de microtúbulos. (A) Tinción de anticuerpos anti-Tea1 de cdc25-22 células bloqueadas durante 3 horas a 36,5 ° C y tratadas con DMSO (arriba) o MBC durante 30, 45 y 60 minutos (abajo). Las células se fijaron en TCA para permitir la visualización de Tea1 en el medio celular. La tinción de Tea1 en el centro celular se pierde con la fijación con metanol. (B) Imágenes de campo claro de cdc25-22 mid1Δ células bloqueadas durante 3 horas a 36,5 ° C y luego durante 1 hora en 50 μg / ml de MBC. Barra, 5 μm.

Tea1 se acumula en el medio de la célula en ausencia de microtúbulos. (A) Tinción de anticuerpos anti-Tea1 de cdc25-22 células bloqueadas durante 3 horas a 36,5 ° C y tratadas con DMSO (arriba) o MBC durante 30, 45 y 60 minutos (abajo). Las células se fijaron en TCA para permitir la visualización de Tea1 en el medio celular. La tinción de Tea1 en el centro celular se pierde con la fijación con metanol. (B) Imágenes de campo claro de cdc25-22 mid1Δ células bloqueadas durante 3 horas a 36,5 ° C y luego durante 1 hora en 50 μg / ml de MBC. Barra, 5 μm.

Observamos que las ramas en las células multinucleadas largas ocurrieron en un orden secuencial, con la primera rama apareciendo cerca del núcleo en el medio de la célula, y las ramas subsecuentes ocurriendo más tarde cerca de núcleos localizados más en la periferia de la célula. Centrifugación de bloqueado cdc11-119 las células en presencia de MBC dieron como resultado la aparición de una primera rama en el 60% de las células, que se desplazó lejos del centro celular cerca de donde se agruparon los núcleos (ver material suplementario Fig. S2C, D).

Concluimos que en ausencia de microtúbulos, la posición de una nueva zona de crecimiento está determinada por la ubicación del núcleo, y que el número final de ramas está determinado por el número de núcleos dentro de la célula en lugar de por ploidía. Sin embargo, los núcleos no son equivalentes y el crecimiento se activa preferentemente cerca de los núcleos más alejados de otras zonas de crecimiento existentes.

Los microtúbulos reposicionan nuevas zonas de crecimiento lejos del núcleo

Cuando hay microtúbulos presentes, la activación de una nueva zona de crecimiento no ocurre en la vecindad del núcleo, lo que sugiere que un factor positivo que activa el crecimiento puede ser transportado fuera del núcleo por los microtúbulos. Un candidato para tal factor es el marcador de polaridad Tea1 (Behrens y Nurse, 2002 Mata y Nurse, 1997). La Fig. 4A muestra que en ausencia de microtúbulos, Tea1 se acumula en el medio de la célula, en la vecindad del núcleo, antes de la aparición de una rama. Para obtener evidencia más directa del papel de Tea1, o un componente del complejo de polaridad Tea1 (Feierbach y Chang, 2001 Martin et al., 2005), siendo necesario para el establecimiento de una nueva zona de crecimiento lejos de las puntas de las células, eliminamos diferentes factores de polaridad en un cdc25-22 antecedentes y se verificó la formación de ramas en presencia de MBC a la temperatura restrictiva. Como se informa en la Tabla 1, aproximadamente el 25% de cdc25-22 tea1Las células Δ se ramifican pero no se observó un aumento significativo en la ramificación tras el tratamiento con MBC. Al final del experimento cdc25-22 las células no eran significativamente más largas que cdc25-22 tea1Δ células (31,5 μm y 30 μm, respectivamente), excluyendo que la falta de ramificación de cdc25-22 tea1Las células Δ se debieron a un crecimiento más lento y, en consecuencia, a un tamaño celular reducido. Como se informa en la Tabla 1, el deterioro de Tea3 (Arellano et al., 2002), Tea4 (Martin et al., 2005), Orb2 (Verde et al., 1998), Bud6 (Glynn et al., 2001) y Pom1 ( Bahler y Pringle, 1998) también provocó una reducción en la eficiencia de ramificación tras la adición de MBC. Eliminando ssp1 no causó ningún cambio en el comportamiento de ramificación en comparación con el mutante único, mientras que la eliminación de mid1 resultó en un gran aumento en la eficiencia de ramificación. Todos cdc25-22 mid1Δ células ramificadas dentro de 1 hora del tratamiento con MBC en comparación con el 10% en el control cdc25-22 celdas (Tabla 1 y Fig. 4B).

Ramificación de mutantes dobles después de 4 horas en MBC

Genotipo. DMSO. MBC.
cdc25-22 0 64%
cdc25-22 tea1Δ 23% 30%
cdc25-22 tea1Δkeltch 26% 28%
cdc25-22 tea4Δ 25% 23%
cdc25-22 bud6Δ 1% 8%
cdc25-22 sla2Δtalin 0 10%
cdc25-22 mid1Δ 0 100% (después de 1 hora)
cdc2-33 0 55%
cdc2-33 ssp1Δ 0 53%
cdc2-33 tea3Δ 0 18%
cdc2-33 orb2-34 0 4%
cdc2-33 pom1Δ 9% 25%
Genotipo. DMSO. MBC.
cdc25-22 0 64%
cdc25-22 tea1Δ 23% 30%
cdc25-22 tea1Δkeltch 26% 28%
cdc25-22 tea4Δ 25% 23%
cdc25-22 bud6Δ 1% 8%
cdc25-22 sla2Δtalin 0 10%
cdc25-22 mid1Δ 0 100% (después de 1 hora)
cdc2-33 0 55%
cdc2-33 ssp1Δ 0 53%
cdc2-33 tea3Δ 0 18%
cdc2-33 orb2-34 0 4%
cdc2-33 pom1Δ 9% 25%

Todas las células se bloquearon durante 3 horas a 36 ° C antes del tratamiento farmacológico.

Si los factores necesarios para el crecimiento polarizado son transportados por los microtúbulos para posicionar una nueva zona de crecimiento, la variación de la longitud de los microtúbulos debería alterar la posición de la rama. Para probar esta posibilidad, realizamos una titulación de MBC en cdc25-22-Células bloqueadas y generadas células bipolares largas que contienen diferentes longitudes de microtúbulos. La Fig.5 muestra que a concentraciones más altas de MBC, los microtúbulos eran más cortos (para células representativas, ver material suplementario Fig. S3), aunque el núcleo permaneció en el centro celular (ver material suplementario Fig. S3), y la rama se formó más lejos del extremos celulares, apoyando la propuesta de que el sistema microtúbulo-Tea1 posiciona la zona de crecimiento. La eficiencia de ramificación varió a lo largo del eje celular largo, alcanzando un máximo en el medio celular más alejado de las puntas que ya estaban creciendo, pero disminuyó significativamente cuando se redujo la concentración de MBC y los microtúbulos se extendieron más cerca de los extremos celulares (Fig. 5C). En conjunto, estas observaciones sugieren que los microtúbulos no son necesarios para el establecimiento del crecimiento celular polarizado, pero son necesarios para colocar un nuevo sitio de crecimiento lejos del núcleo.


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